Här är ett protokoll för att identifiera genetiska interaktioner genom en ökad kopia nummer suppressor skärm i Saccharomyces cerevisiae. Denna metod gör det möjligt för forskare att identifiera, klon, och testa suppressors i kortlivade jäst mutanter. Vi testar effekten av kopian antalet ökning av SIR2 på livslängd i en autofagi null mutant.
Åldrande är den tidsberoende försämringen av en organisms normala biologiska processer som ökar sannolikheten för dödsfall. Många genetiska faktorer bidrar till förändringar i den normala åldrandeprocessen. Dessa faktorer skär varandra på komplexa sätt, vilket framgår av den mängd dokumenterade länkar som identifierats och bevarats i många organismer. De flesta av dessa studier fokuserar på förlust-of-funktion, null mutanter som möjliggör snabb screening av många gener samtidigt. Det finns mycket mindre arbete som fokuserar på att karakterisera den roll som överuttryck av en gen i denna process. I det nuvarande arbetet presenterar vi en okomplicerad metodik för att identifiera och klona gener i den spirande jästen, Saccharomyces cerevisiae, för studier i undertryckande av den kortlivade kronologiska lifespan fenotyp sett i många genetiska bakgrunder. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för forskare från en mängd olika bakgrunder och i olika akademiska stadier. SIR2-genen, som kodar för en histondeacetylase, valdes ut för kloning i pRS315-vektorn, eftersom det har förekommit motstridiga rapporter om dess effekt på den kronologiska livslängden. SIR2 spelar också en roll i autofagi, som resulterar när störs via radering av flera gener, inklusive transkriptionsfaktorn ATG1. Som ett bevis på princip, vi klona SIR2 genen att utföra en suppressor skärm på den förkortade livslängd fenotyp kännetecknande för autofagi bristfällig atg1Δ mutant och jämföra den med en annars isogen, vild typ genetisk bakgrund.
Åldrandet är den tidsberoende förlusten av integritet i otaliga biologiska processer som i slutändan ökar sannolikheten för organismdöd. Åldrande är nästan oundvikligt för alla arter. På cellnivå finns flera väl karakteriserade kännetecken som är förknippade med åldrande, inklusive: genomisk instabilitet, epigenetiska förändringar, förlust-av-proteostasis, mitokondriell dysfunktion, avreglerade näringsämnen avkänning, cellulär senescence, och telomer attrition1,2. I encelliga organismer, såsom jäst, leder detta till en minskning av replikiv potential och kronologisk livslängd3,4. Dessa cellulära förändringar manifesteras i mer komplexa organismer, som människor, som patologier som inkluderar cancer, hjärtsvikt, neurodegeneration, diabetes, och benskörhet5,6,7. Trots de många komplexiteter som kännetecknar processen för åldrande, det finns bevarande av dessa molekylära kännetecken som ligger till grund för denna process över vitt skilda organismer8,9,10. Identifiering av ändringar av dessa vägar under åldrandet ledde till insikten att de kan manipuleras via livsstilsförändringar – kosten begränsning visas väsentligt förlänga livslängden i många organismer11. Dessa vägar konvergerar och skär med varandra och många andra vägar, på komplexa sätt. Elucidation och karakterisering av dessa interaktioner erbjuder potential för terapeutiska insatser för att förlänga livslängd och healthspan12,13,14.
Bevarandet av de molekylära underbyggnad av åldrande möjliggör funktionella dissekering av genetiska interaktioner som ligger till grund för processen genom användning av enklare modell organismer – bland annat i spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae15,16. Det finns två etablerade typer av åldrande modelleras av spirande jäst: kronologiskt åldrande (den kronologiska livslängd, CLS) och replikiv åldrande (den replikiva livslängd, RLS)17. Kronologiskt åldrande mäter den tid som en cell kan överleva i ett icke-splittrande tillstånd. Detta är analogt med det åldrande som ses i celler som tillbringar majoriteten av sitt liv i G0, såsom nervceller4. Alternativt är replikiv livslängd det antal gånger som en cell kan dela sig före utmattning och är en modell för mitotiskt aktiva celltyper (t.ex. antalet dotterceller som en cell kan ha)18.
Det övergripande målet med denna metod är att presentera ett protokoll som möjliggör den funktionella dissektion av genetik åldrandet med hjälp av S. cerevisiae. Även om det har varit många utmärkta studier som utförs av många forskare som har lett till vår nuvarande förståelse, det finns fortfarande många möjligheter för spirande forskare att bidra till det åldrande området från början av sin akademiska karriär. Vi presenterar en tydlig metod som gör det möjligt för forskare att ytterligare avancera på åldrandet. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för alla forskare oavsett stadium i deras akademiska karriär genom att tillhandahålla de verktyg som krävs för att formulera och testa sina egna nya hypoteser. Fördelen med vårt tillvägagångssätt är att detta är en kostnadseffektiv metod lättillgänglig för alla forskare oavsett institution – och kräver inte dyr, specialiserad utrustning som är nödvändig för vissaprotokoll 19. Det finns flera olika sätt att utforma denna typ av skärm, det tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete är särskilt mottagliga för screening null mutanter av icke-väsentliga gener som uppvisar en allvarlig minskning av den kronologiska livslängden jämfört med en isogen vild-typ stam av jäst.
Som vårt bevis på princip, vi klon SIR2, en lysin deacetylase rapporteras som uppvisar både en förlängd och en förkortad CLS när overexpressed. SIR2 överuttryck konstaterades nyligen att öka CLS i vinframställning jäst; emellertid har flera grupper rapporterat någon koppling mellan SIR2 och CLS förlängning, lämnar sin roll under karakteriseras20,21,22. På grund av dessa motstridiga rapporter i litteraturen, vi valt denna gen för att lägga till oberoende forskning för att hjälpa klargöra rollen av SIR2 i kronologiskt åldrande, om någon. Dessutom ökar kopian antalet av en SIR2 homolog förlänger livslängd i en nematod mask modellsystem23.
Autofagi är ett intracellulärt nedbrytningssystem för att leverera cytosoliska produkter, såsom proteiner och organeller, till lysosomen24. Autofagi är intimt kopplad till livslängd genom sin roll i förnedrande skadade proteiner och organeller för att upprätthålla cellulär homeostas25. Induktion av autofagi beror på att iscensätta uttrycket av många gener, och strykningen av ATG1 genen resulterar i en onormalt kort CLS i spirande jäst26. ATG1-koder för ett protein serin/treoninkinas som krävs för vesikelbildning i autofagi och cytoplasman-till-vakuol (svampen lysosomekvivalent) utbildningsavsnitt27,28. Här presenterar vi vår metod för en ökad kopia nummer skärm, testa effekten av ökad SIR2 kopia på CLS i en vild typ och en atg1-null bakgrund. Denna metod är särskilt mottaglig för yngre forskare och forskargrupper vid främst grundutbildningsinstitutioner, av vilka många tjänar samhällen underrepresenterade inom vetenskap och har begränsade resurser.
Att reda ut åldrandets genetik är en svår utmaning, med många möjligheter till ytterligare studier som potentiellt kan ge betydande insikter i de komplexa interaktioner som finns. Det finns många metoder som möjliggör en snabb generering av förlust-of-funktion mutanter för studier av null stammar av jäst45,46. Denna metod presenterar en enkel metod för att identifiera och klona gener på pRS315 vektorn för overexpression suppressor studier. En förde…
The authors have nothing to disclose.
James T. Arnone vill ge sitt erkännande till stödet från studenterna i kursen Rekombinant DNA Technologies under 2017 och 2018 vid William Paterson University som var involverade i detta projekt från starten, men vars insatser inte gick över tröskeln för författarskap: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin gamarra, Precious Isbori , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza’e, Gabriella Rektor, Aida Shono, och Matthew So. Ni är stora vetenskapsmän och jag saknar er alla!
Författarna vill erkänna ovärderligt stöd för instruktion och forskningsteknik vid William Paterson University för deras hjälp: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella och Henry Heinitsh. Författarna vill också erkänna kontoret för Provost för ART stöd, office of the Dean och Centrum för forskning vid College of Science and Health sitt stöd för detta arbete, och Institutionen för biologi för att stödja detta projekt.
Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |