GFP 발현 골세포의 쥐 두개골 분획을 통한 1차 골세포 획득
Summary
이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 골세포 준비 외에도 신생아 dmp1-topaz 마우스 두개골의 해부와 세포 소화 및 분획을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 골세포의 분리를 설명합니다.
Abstract
한때 기계적 부하를 감지하는 무대 뒤 기능을 감안할 때 뼈의 수동적 거주자로 생각되었던 골 세포는 이제 주목을 받고 있으며 세포 외 기질을 능동적으로 수정하고 내분비 기관을 형성하는 것과 같은 여러 주요 기능을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 시험관 내에서 분리된 일차 골세포에서 골세포 유사 세포주로 골세포를 테스트할 수 있게 된 방법 덕분에 골세포는 이제 구조와 기능에 대한 엄청난 관심과 지식의 급증을 경험하고 있습니다. 골세포 생물학의 많은 측면과 다른 분자 구성 요소와의 상호 작용은 아직 발견되지 않았습니다. 이 프로토콜에서 우리는 세포 분획 및 이후 FACS에 의한 1차 골세포의 배양을 통해 골세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 dmp1-topaz 신생아 마우스 calvaria에서 1차 골세포의 효율적인 분리를 자세히 설명합니다.
Introduction
Osteocytes는 분비된 기질1에 묻힌 조골세포 전구체로부터 말단적으로 분화된 세포입니다. 그들은 뼈 세포 집단 중에서 가장 풍부하고 가장 오래 사는 세포입니다. 그들은 lacunae 내에 거주하며 주변 환경 및 뼈 표면과의 광범위한 통신 및 대사 교환 네트워크를 형성하는 canaliculi라는 채널을 통해 확장되는 수상 돌기와 함께 특징적인 별 모양 형태를 가지고 있습니다2. 골세포는 뼈 리모델링에서 조골세포와 파골세포 역할을 모두 수행하며,기계적 부하에 대한 적응을 부여하는 주요 기계감각 세포이며3, 인산염 항상성(phosphate homeostasis)4 및 골기질 광물화(bone matrix mineralization)5에 관여하며, 열수관(lacunocanalicular) 시스템과 함께 먼 조직에 신호를 보내는 내분비 기관으로 작용한다6.
Osteocytes는 광물화된 매트릭스 내에 위치하여 접근성을 제한하고 분리를 어렵게 만들어 체외 조사를 방해합니다. 첫 번째 분리 방법 중 하나는 나중에 PHEX(X 염색체의 엔도펩티다아제와 상동성을 갖는 PHosphate-regulating gene)8의 조류 변이체로 알려진 골세포 특이적 단클론 항체(OB7.3)를 사용하여 닭 두개골에서 골세포를 분리하는 것이었습니다. 다른 연구자들은 쥐9 또는 마우스 10 긴 뼈의 순차적 소화를 사용하여 골세포 순도가 약70 %인 것으로 보고된 골세포가 풍부한 분획을 얻었습니다9. 이 절차의 한계에는 골세포 이외의 다른 세포 유형으로 오염된 배양물의 최적이 아닌 순도와 골세포가 분열하는 능력을 상실했기 때문에 배양 중인 다른 세포에 의해 골세포가 잠재적으로 과도하게 자랄 수 있다는 것이 포함됩니다. 이러한 문제는 장기 문화의 유용성을 제한합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 골세포 세포주가 개발되었습니다. MLO-Y4 세포주11 및 MLO-A5 세포주12는 특히 초기 단계 골세포 연구에 유용한 가장 널리 연구된 세포주입니다. 그러나 이들은 성숙한 골세포 마커인 sclerostin과 FGF2313의 낮은 수준을 발현하기 때문에 성숙한 골세포 신호 전달을 연구하는 데 덜 유용하다. IDG-SW314 및 Ocy45415를 포함하는 다른 세포주는 높은 수준의 스클레로스틴 및 FGF23을 발현하며 후기 골세포 단계를 연구하는 데 유용합니다. 세포주는 유용한 연구 도구임이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 일차 세포의 생물학을 완전히 나타내지 않기 때문에 제한없이 오지 않습니다. 상이한 세포주는 골세포 성숙 스펙트럼의 상이한 발달 단계를 나타내며, 세포주는 원발성 골세포의 이질성을 나타내지 못한다16,17.
일차 골세포의 순수 배양을 얻기 위해, 연구자들은 8kb dmp1 프로모터가 골세포에서 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 유도하는 데 사용되는 cre 마우스 모델을 활용했다18,19. Paic et al.19에 의한 이중 형질전환 마우스(pOB-Col 2.3-GFP-cyan 및 DMP1-GFP-topaz)와 Nakashima et al.20에 의한 dmp1-topaz 형질전환 마우스를 사용하여 골세포 개체군을 얻었습니다. 그들은 1차 골세포의 배양물을 획득하기 위해 GFP를 발현하는 골세포의 순차적 소화 및 FACS를 사용했습니다19,20. tdTomato 단백질을 활성화시키는 10kb dmp1 리포터 마우스 Ai9에서 cre의 방향은 골수, 조골세포, 근육 및 골수 내 세포에 존재하는 것으로 나타났습니다. 8-kb dmp1 프로모터는 동일한 발현 패턴을 가졌지만, 조골세포와 골수 세포의 일부만이 단백질을 발현하였으며, 이는 8-kb dmp1 프로모터가 더 특이적임을 나타낸다21. 그럼에도 불구하고, 8kb dmp1 프로모터를 사용하여 얻은 결과는 주의해서 해석되어야 하며, 유전자 발현 프로파일은 얻어진 집단이 충분히 높은 순도를 갖도록 하기 위해 골세포 대 조골세포 특이적 마커를 사용하여 일상적으로 수행되어야 합니다.
파골세포 마커 OSCAR 및 Ddcamp는 조혈되지 않은 고갈 대 고갈된 골세포 집단에서 발견되었으며, 이 발견으로 인해 저자는 8kb dmp1-topaz 신생아 calvaria 및 GFP 분류의 분획에서 얻은 소화가 조혈 세포로 오염되어 있다고 결론지었습니다. GFP 양성 조혈 세포는 GFP 양성 중간엽 세포(골세포)보다 GFP 강도가 상당히 낮기 때문에 조혈 세포의 오염은 GFP 분류 게이트를 조임으로써 완화될 수 있었습니다22.
시험관 내에서 골세포를 연구하는 방법은 골세포 생물학에 대한 최근의 풍부한 정보에 기여했습니다. 그러나 골세포 분리는 세포 수율이 낮은 노동 집약적이고 긴 절차로 남아 있습니다. 콜라게나제와 EDTA를 사용하여 종종 분획 823까지 뼈 소화의 설명 된 방법은 골 세포 생존력에 세금이 부과되는 몇 시간이 걸립니다. 연구자들은 세포 분류를 위해 분획(fractions)(2\u20125)을 사용했다고 보고했으며20, 조골세포와 관련된 유전자의 발현 프로필과 조골세포의 유전자 발현 프로필이 순수한 골세포 개체군을 분리하는 데 성공했음을 확인해준다는 것을 보여주었다20. 이 기사에서는 분획(2\u20125)을 얻는 과정을 설명하고 분획 1부터 8까지 시작하는 각 분획의 골세포 수율을 비교하여 각 분획에서 골세포의 반환을 결정합니다. 우리는 또한 신생아 dmp1-topaz 마우스 calvaria의 해부와 collagenase 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 사용한 calvarial 소화뿐만 아니라 FACS를위한 세포의 준비에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최초로 분리된 골세포는 닭 calvaria7 (OB7.3) 또는 PHEX의 조류 변이체를 사용하여 분리하였다; 그러나, 이 방법은 또한 종 특이적인 골세포 특이적 항체가 제조되어야 하기 때문에 실행 가능한 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 연구자들은 마우스와 쥐의 긴 뼈에서 골 세포를 얻기 위해 순차적 효소 과정의 다른 변형을 사용했습니다. 보고된 이러한 배양물의 순도는 약 70%로 설정되?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (H.K.에 No. 19K10397, I.M.에 No. 18K09862)의 JSPS KAKENHI 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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