레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석
Summary
여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.
Abstract
복잡한 다세포 유기체의 발달은 상이한 전사 단면도가 있는 명백한 세포 모형에 의해 지배됩니다. 발달 과정을 제어하는 전사 적 규제 네트워크를 식별하려면 이러한 개별 세포 유형의 공간 및 측두성 유전자 발현 프로파일을 측정할 필요가 있습니다. 따라서 유전자 발현의 현세-측량 제어에 대한 통찰력은 생물학적 및 발달 과정이 어떻게 규제되는지 이해하는 데 필수적입니다. 여기서는 발아 중에 시간 과정을 통해 3개의 보리 배아 기관에서 소수의 세포를 분리하는 레이저 포획 미세 절(LCM) 방법을 설명하고 전사체 프로파일링을 실시한다. 이 방법은 조직 고정, 조직 처리, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출 다음으로 실시간 PCR 또는 RNA-seq로 구성됩니다. 이 방법을 통해 종자 장기 전사의 공간적 및 측두프로파일을 다양한 수의 세포(수십~수백 개)에서 얻을 수 있게 되어 일반적인 벌크 조직 분석보다 훨씬 더 큰 조직 특이성을 제공합니다. 이러한 데이터에서 우리는 전사 적 규제 네트워크를 정의하고 비교할 뿐만 아니라 개별 조직에 대한 후보 규제 전사 요인을 예측할 수 있었습니다. 이 방법은 최소한의 최적화를 가진 다른 플랜트 조직에 적용되어야 합니다.
Introduction
식물 개발 및 성장은 복잡한 세포 환경에 존재하는 다른 세포 내의 전사 규제 네트워크의 조정 된 작용을 포함한다. 이러한 규제 네트워크의 활동을 이해하기 위해, 우리는 발달 단계에 걸쳐 다른 세포 모형 내의 공간 및 측두성 유전자 발현의 지식을 요구합니다. 그러나, 유전자 발현의 분석은 세포의 작은 숫자를 격리하고 분석의 기술적 인 도전 때문에 전체 기관 또는 대량 조직 샘플에서 더 일반적으로 수행됩니다. 여기서 설명하는 방법은 LCM과 RNA-seq를 결합하여 공간 및 측두조직 특이적 전사 분석을 얻을 수 있게 하였다.
LCM은 에머트 벅과 동료에머트벅에 의해 이십 년 전에 개발되었다 1 . 이 기술을 통해 연구자들은 좁은 빔 레이저1을사용하여 직접 현미경 시각화 및 조작을 사용하여 단일 세포 또는 세포 클러스터를 환경으로부터 정확하게 분리할 수 있었습니다. 그 이후로 이 방법은 암 생물학 및 병리학2,,3에서널리 사용되고 있다. ,많은 식물 연구 그룹은 또한 다른 식물 종 및 다른 조직 유형,4,,5,,6,7,8,9,10,11과함께 사용하기 위해,LCM을적응시켰다. 최근에는, 몇몇 논문은 또한 종자 발달 및 발아 도중 배아, 내배식 및 그밖 종자 구조물을 공부하기 위하여 eudicot 및 단장화장 씨앗에LCM을 이용했습니다10,,12,13. 마이크로 파이펫팅, 세포 선별, 자기 분리 및 미세 유체 플랫폼과 같은 다른 일반적으로 사용되는 단일 세포 격리 방법의 대부분은 세포를 해리하기 위해 효소 소화 또는 기계적 균질화에 의존한다. 이는 데이터해석(14,15)을혼동하는 기술 적 유물을 도입하여 유전자발현을방해할 수 있다. 이러한 방법은 또한 해리된 세포를 공간 위치 및 진정한 세포 유형에 연관시키기 위해 각 세포 유형에 대한 마커 유전자에 대한 이전 지식을 요구합니다. 기술의 추가 그룹은 전체 세포 대신 세포 체형 구조의 친화성 기반 절연에 따라 달라집니다, 예를 들어 INTACT (세포 유형에서 태그 핵의 격리) 및 TRAP (리보솜 친화 정화 번역)16,,17. 그러나 핵 이나 리보좀의 선호도 라벨링 및 정제는 잘 확립 된 변형 프로토콜이없는 식물 종에서 기술적으로 도전적입니다. LCM은 짧은기간동안 이산 세포를 단기간에 격리할 수 있도록 하는 정상 조직/장기 문맥 내에서 세포의 직접 시각화에 의한 성적증명서 수준 및 종래의 조직학적 식별을 보존하기 위해 빠른 조직 고정을활용한다.19
여기에 제시된 프로토콜은 조직학적으로 식별될 수 있는 대부분의 세포에 적용될 수 있는 시리얼 씨앗의 조직 섹션에서 특정 세포 또는 세포 유형의 분리를 위한 최적화된 방법입니다. LCM은 접촉없는 세포 격리 방법을 제공하여 오염을 크게 줄이고 회수 된 RNA의 무결성을 증가시킵니다. 더욱이, 이 방법은 소량의 생물학적 물질로 시작하는 대규모 게놈 넓은 연구에 대한 LCM의 힘을 보여줍니다. 우리는 또한 다운스트림 전사/전사 분석을 위한 충분한 입력 물질을 생성하기 위한 RNA의 선형 증폭을 기술합니다.
이 LCM RNA-seq 프로토콜에는 조직 샘플, 탈수, 파라핀 침투, 임베딩, 단면, LCM, RNA 추출, RNA 증폭, RNA 정량화 및 qRT-PCR 및/또는 RNA-seq(그림1)의고정을 포함하는 공간 및 측두조직 특이적 전사에 대한 10가지 주요 단계가 있습니다.
그림 1: LCM의 순서도는 RNA-seq 또는 qRT-PCR이 그 뒤를 따릅니다. LCM은 현미경 시각화 하에서 레이저 빔을 사용하여 고정 조직 섹션에서 세포를 수집하는 공간적으로 정확하고 접촉이 없는 기술입니다. 이 과정은 조직 샘플의 고정으로 시작하여 에탄올과 자일렌의 그라데이션 시리즈를 사용하여 탈수로 시작하여 파라핀 침투로 완성됩니다. 이 과정은 티슈 프로세서를 사용하여 완전히 자동화될 수 있습니다. 조직이 파라핀으로 침투하면 포함 스테이션을 사용하여 용융 파라핀이있는 금형에 내장됩니다. 절제는 원하는 두께로 설정된 마이크로토메를 사용하여 수행됩니다. 슬라이드는 RNA가 포획된 세포에서 추출되기 직전에 제조되고 LCM이 수행됩니다. RNA 추출은 qRT-PCR 및/또는 RNA-seq 이전에 RNA 증폭의 2라운드에 의해 직접 뒤따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 조직 별 유전자 발현 연구는 시간이 많이 소요되는, 노동 집약적인 시료의 손 해부에 의해 제한되었으며, 오염위험이 높으며 인간 수술이 수확하기에 충분히 손재주적이라는 시료만 활용할 수 있습니다. LCM은 현미경 시각화 하에서 기계적으로 작동하는 레이저 빔을 사용하여 고정 조직 섹션에서 세포를 수집하는 정확하고 접촉없는 기술입니다.
좋은 샘플 준비는 LCM에 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 식물 에너지 생물학 (CE140100008)에서 JW에 우수의 호주 연구 위원회 센터에 의해 지원되었다. M.G.L은 라 트로브 대학 시작 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 높은 처리량 시퀀싱 및 데이터 분석에 대한 지원에 대한 La Trobe 유전체학 플랫폼에 감사드립니다. 우리는 우리의 실험실에서 LCM을 설립에 대한 전문가의 조언을 준 교수 매튜 터커 에게 감사드립니다.
Materials
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
Referências
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