Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para microdisseção de captura a laser (LCM) de tecidos vegetais. LCM é uma técnica microscópica para isolar áreas de tecido de forma livre de contaminação. O procedimento inclui fixação tecidual, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA. O RNA é usado na análise temporalmente resolvida do tecido a jusante dos transcriptomes.

Abstract

O desenvolvimento de um complexo organismo multicelular é regido por tipos de células distintas que têm diferentes perfis transcricionais. Para identificar redes regulatórias transcricionais que regem os processos de desenvolvimento é necessário medir os perfis de expressão genética espacial e temporal desses tipos de células individuais. Portanto, a visão sobre o controle espóvio-temporal da expressão genética é essencial para obter a compreensão de como os processos biológicos e de desenvolvimento são regulados. Aqui, descrevemos um método de microdissecção de captura a laser (LCM) para isolar um pequeno número de células de três órgãos de embrião de cevada durante um curso de tempo durante a germinação seguido de perfil de transcrição. O método consiste em fixação tecidual, processamento de tecidos, incorporação de parafina, secção, LCM e extração de RNA seguido de PCR em tempo real ou RNA-seq. Este método nos permitiu obter perfis espaciais e temporais de transcritos de órgãos de sementes de diferentes números de células (dezenas a centenas), fornecendo uma especificidade tecidual muito maior do que as análises típicas de tecido a granel. A partir desses dados, conseguimos definir e comparar redes regulatórias transcricionais, bem como prever fatores de transcrição regulatória de candidatos para tecidos individuais. O método deve ser aplicável a outros tecidos vegetais com otimização mínima.

Introduction

O desenvolvimento e o crescimento das plantas envolvem a ação coordenada de redes reguladoras transcricionais dentro de diferentes células que existem em um ambiente celular complexo. Para entender a atividade dessas redes regulatórias, exigimos o conhecimento da expressão genética espacial e temporal dentro de diferentes tipos de células em estágios de desenvolvimento. No entanto, as análises da expressão genética são mais comumente conduzidas em órgãos inteiros ou amostras de tecido a granel devido ao desafio técnico de isolar e analisar um pequeno número de células. O método que descrevemos aqui permitiu a obtenção de análises de transcriptome espacial e temporal e....

Protocol

Como o produto final é RNA, tome cuidado para evitar contaminar o trabalho com RNases. Usar luvas é imperdível. Use pirocarbonato dietil (DEPC) -água tratada, tampões, etc. Tampões de autoclave e assar vidros antes de usar.

1. Fixação de tecidos

1. Preparar fixação de escolha dependendo das espécies e tipos de tecidos; para sementes de cevada, use o fixador do Farmer (75% de etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).
2. Esfrie o fixador no gelo antes de colher tecidos.
3. Colete o material vegetal de interesse e, se necessário, disseca-o em pedaços de tamanho apropriado para caber no molde de incorporação selecionado. Pa....

Results

Geramos transcrições espaciais e temporais específicas de tecidoes a partir de sementes de cevada durante a germinação usando nosso protocolo LCM RNA-seq¹⁰. O estudo foi realizado aplicando LCM RNA-seq a um pequeno número de células de três órgãos embrionários (plumule, ponta de radículo, scutellum) a cada 8 h durante um curso de tempo de 48h durante a germinação (0-48 h, 7 pontos de tempo)(Figura 2A,B).

Discussion

Muitos estudos de expressão genética específicos do tecido têm sido limitados pela dissecação manual de amostras, que é demorado, trabalhoso, tem um alto risco de contaminação e só pode utilizar amostras que um agente humano é suficientemente hábil para colher. LCM é uma técnica precisa e livre de contatos para coletar células de seções de tecido fixo usando um raio laser operado mecanicamente sob visualização microscópica.

Uma boa preparação amostral é fundamental para LCM. O processo conta c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaco	Zeiss	415190-9181-000
Moldes de base transparente 8 X 10	Leica	3803015
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
Fita de Tela de RNA de Alta Sensibilidade	Agilent	5067-5579
Baixo&tímido; lâminas de perfil DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
Kit de amplificação de aRNA MessageAmp II	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
Conjunto de digestão DNase I na coluna	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Parafina (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
Kit de isolamento de RNA PicoPure	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
Solução de descontaminação de RNase RNaseZap	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xileno	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Processador de tecidos de bancada Leica	Biosystems	TP1020
Módulo de incorporação de parafina aquecida Leica	Biosystems	EG1150H
Placa fria Leica	Gabinetes de segurança biológica Safemate Classe 2 da	Leica Biosystems
	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Micrótomo rotativo totalmente automatizado	Leica Biosystems	RM2265	com software PALMRobo v 4.6
Sistema Zeiss PALM MicroBeam LCM Fita	Zeiss
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200