Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides
Summary
Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.
Abstract
Los modelos organoides epiteliales sirven como herramientas valiosas para estudiar la biología básica de un sistema de órganos y para el modelado de enfermedades. Cuando se cultivan como organoides, las células progenitoras epiteliales pueden autorrenovarse y generar una progenie diferenciadora que exhibe funciones celulares similares a las de sus contrapartes in vivo . A continuación describimos un protocolo paso a paso para aislar progenitores específicos de la región del pulmón humano y generar cultivos organoides 3D como herramienta experimental y de validación. Definimos las regiones proximales y distales del pulmón con el objetivo de aislar las células progenitoras específicas de la región. Utilizamos una combinación de disociación enzimática y mecánica para aislar las células totales del pulmón y la tráquea. Las células progenitoras específicas se fraccionaron de las células de origen proximal o distal utilizando la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS) basada en marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR para clasificar las células basales y HTII-280 para clasificar las células alveolares tipo II. Se utilizaron progenitores basales o alveolares aislados de tipo II para generar cultivos organoides 3D. Tanto los progenitores distales como los proximales formaron organoides con una eficiencia de formación de colonias del 9-13% en la región distal y del 7-10% en la región proximal cuando se chapan 5000 células / pozo en el día 30. Los organoides distales mantuvieron las células alveolares tipo II HTII-280+ en cultivo, mientras que los organoides proximales se diferenciaron en células ciliadas y secretoras para el día 30. Estos cultivos organoides 3D se pueden utilizar como una herramienta experimental para estudiar la biología celular del epitelio pulmonar y las interacciones mesenquimales epiteliales, así como para el desarrollo y validación de estrategias terapéuticas dirigidas a la disfunción epitelial en una enfermedad.
Introduction
Los espacios aéreos del sistema respiratorio humano se pueden dividir ampliamente en zonas conductoras y respiratorias que median el transporte de gases y su posterior intercambio a través de la barrera epitelial-microvascular, respectivamente. Las vías respiratorias conductoras incluyen tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos terminales, mientras que los espacios de aire respiratorio incluyen bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y alvéolos. El revestimiento epitelial de estos espacios aéreos cambia de composición a lo largo del eje proximo-distal para adaptarse a los requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. El epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias traqueobronquiales está compuesto por tres tipos principales de células, basales, secretoras y ciliadas, además de los tipos celulares menos abundantes, incluidos el cepillo, el neuroendocrino y el ionocito 1,2,3. Las vías respiratorias bronquiolares albergan tipos de células epiteliales morfológicamente similares, aunque hay distinciones en su abundancia y propiedades funcionales. Por ejemplo, las células basales son menos abundantes dentro de las vías respiratorias bronquiolares, y las células secretoras incluyen una mayor proporción de células club frente a las células serosas y caliciformes que predominan en las vías respiratorias traqueobronquiales. Las células epiteliales de la zona respiratoria incluyen un tipo de célula cuboidal mal definida en los bronquiolos respiratorios, además de las células alveolares tipo I (ATI) y tipo II (ATII) de los conductos alveolares y alvéolos 1,4.
La identidad de los tipos de células madre epiteliales y progenitoras que contribuyen al mantenimiento y renovación de los epitelios en cada zona se describe de forma incompleta y se infiere en gran medida de los estudios en modelos animales 5,6,7,8. Los estudios en ratones han demostrado que las células basales de las vías respiratorias pseudoestratificadas, o las células club de las vías respiratorias bronquiolares o las células ATII del epitelio alveolar, sirven como células madre epiteliales basadas en la capacidad de autorrenovación ilimitada y diferenciación multipotente 7,9,10,11,12 . A pesar de la incapacidad de realizar estudios de rastreo de linaje genético para evaluar el tallo de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas, la disponibilidad de modelos de cultivo basados en organoides para evaluar el potencial funcional de las células madre y progenitoras epiteliales proporciona una herramienta para estudios comparativos entre ratones y humanos 13,14,15,16,17.
Describimos métodos para el aislamiento de tipos de células epiteliales de diferentes regiones del pulmón humano y su cultivo utilizando un sistema organoide 3D para recapitular los tipos de células regionales. Se han desarrollado métodos similares para el análisis funcional y el modelado de enfermedades de células epiteliales de otros sistemas de órganos 18,19,20,21. Estos métodos proporcionan una plataforma para la identificación de células progenitoras epiteliales regionales, para realizar estudios mecanicistas que investiguen su regulación y microambiente, y para permitir el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Aunque los estudios de células progenitoras epiteliales pulmonares realizados en modelos animales pueden beneficiarse del análisis, ya sea in vivo o in vitro, los conocimientos sobre la identidad de las células progenitoras epiteliales pulmonares humanas han dependido en gran medida de la extrapolación de organismos modelo. Como tal, estos métodos proporcionan un puente para relacionar la identidad y el comportamiento de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas con sus estudios que investigan la regulación de las células madre / progenitoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un método confiable para el aislamiento de subpoblaciones definidas de células pulmonares del tejido pulmonar humano para análisis molecular o funcional y modelado de enfermedades. Los elementos críticos de los métodos incluyen la capacidad de lograr la disociación tisular con la preservación de epítopos superficiales, que permiten el enriquecimiento mediado por anticuerpos de células recién aisladas, y la optimización de los métodos de cultivo para la generación eficiente de organoides epitelial…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de Mizuno Takako para IFC y tinción H y E, Vanessa García para la seccionamiento de tejidos y Anika S Chandrasekaran por ayudar con la preparación del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) y el Consorcio Celgene IDEAL.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
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