عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية
Summary
توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لتفكك الأنسجة ونهج التجزئة الخلوية التي تسمح بإثراء الخلايا الظهارية القابلة للحياة من المناطق القريبة والبعيدة من الرئة البشرية. هنا يتم تطبيق هذه الأساليب للتحليل الوظيفي للخلايا السلفية الظهارية الرئوية من خلال استخدام نماذج ثقافة العضوية 3D.
Abstract
تعمل النماذج العضوية الظهارية كأدوات قيمة لدراسة البيولوجيا الأساسية لنظام الأعضاء ونمذجة الأمراض. عندما تنمو كمواد عضوية ، يمكن للخلايا السلفية الظهارية أن تجدد نفسها وتولد ذرية متمايزة تظهر وظائف خلوية مشابهة لتلك الخاصة بنظيراتها في الجسم الحي . هنا نصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل الأسلاف الخاصة بالمنطقة عن الرئة البشرية وتوليد ثقافات عضوية 3D كأداة تجريبية والتحقق من الصحة. نحن نحدد المناطق القريبة والبعيدة من الرئة بهدف عزل الخلايا السلفية الخاصة بالمنطقة. استخدمنا مزيجا من التفكك الأنزيمي والميكانيكي لعزل الخلايا الكلية عن الرئة والقصبة الهوائية. ثم تم تقسيم خلايا السلف المحددة من الخلايا الأصلية القريبة أو البعيدة باستخدام فرز الخلايا المرتبطة بالتألق (FACS) استنادا إلى علامات السطح الخاصة بنوع الخلية ، مثل NGFR لفرز الخلايا القاعدية و HTII-280 لفرز الخلايا السنخية من النوع الثاني. تم استخدام السلف القاعدية أو السنخية المعزولة من النوع الثاني لتوليد ثقافات عضوية 3D. شكل كل من السلف البعيد والقريب عضويات ذات كفاءة تشكيل مستعمرة بنسبة 9-13٪ في المنطقة البعيدة و 7-10٪ في المنطقة القريبة عند طلاء 5000 خلية / بئر في اليوم 30. حافظت المواد العضوية البعيدة على خلايا HTII-280 + السنخية من النوع الثاني في الثقافة بينما تميزت المواد العضوية القريبة إلى خلايا هدبية وإفرازية بحلول اليوم 30. يمكن استخدام هذه الثقافات العضوية 3D كأداة تجريبية لدراسة بيولوجيا الخلية من ظهارة الرئة والتفاعلات الوسيطة الظهارية ، وكذلك لتطوير والتحقق من صحة الاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف الخلل الظهاري في المرض.
Introduction
يمكن تقسيم المساحات الهوائية للجهاز التنفسي البشري على نطاق واسع إلى مناطق موصلة وتنفسية تتوسط في نقل الغازات وتبادلها اللاحق عبر الحاجز الظهاري الوعائي الدقيق ، على التوالي. تشمل الشعب الهوائية الموصلة القصبة الهوائية والشعب الهوائية والقصيبات الهوائية والقصيبات الطرفية ، في حين تشمل مجالات الهواء التنفسية القصيبات التنفسية والقنوات السنخية والحويصلات الهوائية. تتغير البطانة الظهارية لهذه المجالات الجوية في التركيب على طول المحور القريب والبعيد لاستيعاب المتطلبات الفريدة لكل منطقة متميزة وظيفيا. تتكون الظهارة الزائفة الطبقية للممرات الهوائية القصبية الهوائية من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا ، القاعدية والإفرازية والهدبية ، بالإضافة إلى أنواع الخلايا الأقل وفرة بما في ذلك الفرشاة والغدد الصماء العصبية والخلايا الأيونية1،2،3. تؤوي الشعب الهوائية القصبية أنواعا من الخلايا الظهارية المتشابهة من الناحية المورفولوجية ، على الرغم من وجود فروق في وفرتها وخصائصها الوظيفية. على سبيل المثال ، الخلايا القاعدية أقل وفرة داخل الشعب الهوائية القصبية ، وتشمل الخلايا الإفرازية نسبة أكبر من خلايا النادي مقابل الخلايا المصلية والكأسية التي تسود في الشعب الهوائية القصبية الهوائية. تشمل الخلايا الظهارية في المنطقة التنفسية نوعا من الخلايا المكعبة غير المحددة بشكل جيد في القصيبات التنفسية ، بالإضافة إلى الخلايا السنخية من النوع الأول (ATI) والنوع الثاني (ATII) من القنوات السنخية والحويصلات الهوائية 1,4.
يتم وصف هوية أنواع الخلايا الجذعية الظهارية والسلف التي تساهم في الحفاظ على الظهارة وتجديدها في كل منطقة بشكل غير كامل ويتم استنتاجها إلى حد كبير من الدراسات التي أجريت على النماذج الحيوانية5،6،7،8. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران أن الخلايا القاعدية في الشعب الهوائية الزائفة ، أو الخلايا النادية للممرات الهوائية القصيبية أو خلايا ATII في الظهارة السنخية ، تعمل كخلايا جذعية ظهارية بناء على القدرة على التجديد الذاتي غير المحدود والتمايز متعدد القدرات 7,9,10,11,12 . على الرغم من عدم القدرة على إجراء دراسات تتبع النسب الوراثي لتقييم جذع أنواع الخلايا الظهارية الرئوية البشرية ، فإن توافر نماذج الثقافة العضوية لتقييم الإمكانات الوظيفية للخلايا الجذعية الظهارية والسلف يوفر أداة للدراسات المقارنة بين الفأر والإنسان13،14،15،16،17.
نحن نصف طرق عزل أنواع الخلايا الظهارية من مناطق مختلفة من الرئة البشرية وثقافتها باستخدام نظام عضوي 3D لتلخيص أنواع الخلايا الإقليمية. تم تطوير طرق مماثلة للتحليل الوظيفي ونمذجة الأمراض للخلايا الظهارية من أنظمة الأعضاء الأخرى18،19،20،21. توفر هذه الطرق منصة لتحديد الخلايا السلفية الظهارية الإقليمية ، لإجراء دراسات ميكانيكية تبحث في تنظيمها وبيئتها الدقيقة ، وتمكين نمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت على الخلايا السلفية الظهارية الرئوية التي أجريت في النماذج الحيوانية يمكن أن تستفيد من التحليل ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر ، إلا أن الأفكار حول هوية الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية كانت تعتمد إلى حد كبير على الاستقراء من الكائنات الحية النموذجية. على هذا النحو ، توفر هذه الطرق جسرا لربط هوية وسلوك أنواع الخلايا الظهارية للرئة البشرية مع دراساتها التي تبحث في تنظيم الخلايا الجذعية / السلفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف طريقة موثوقة لعزل مجموعات فرعية محددة من خلايا الرئة عن أنسجة الرئة البشرية إما للتحليل الجزيئي أو الوظيفي ونمذجة الأمراض. وتشمل العناصر الحاسمة للطرق القدرة على تحقيق تفكك الأنسجة مع الحفاظ على الظهارات السطحية، والتي تسمح بالإثراء بوساطة الأجسام المضادة للخلايا المعزولة حديث?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدعم المقدم من ميزونو تاكاكو لمؤسسة التمويل الدولية و H و E تلطيخ ، فانيسا غارسيا لتقسيم الأنسجة و Anika S Chandrasekaran للمساعدة في إعداد المخطوطات. يتم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (5RO1HL135163-04 ، PO1HL108793-08) واتحاد Celgene IDEAL.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
