Method Article

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

DOI:

10.3791/61541

⸱

July 21st, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

In This Article

Summary

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Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Abstract

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Modelos organoides epiteliais servem como ferramentas valiosas para estudar a biologia básica de um sistema de órgãos e para modelagem de doenças. Quando cultivadas como organoides, as células progenitoras epiteliais podem se auto-renovar e gerar progêneres diferenciais que exibem funções celulares semelhantes às de suas contrapartes in vivo . Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar progenitores específicos da região do pulmão humano e gerar culturas organoides 3D como uma ferramenta experimental e de validação. Definimos regiões proximais e distais do pulmão com o objetivo de isolar células progenitoras específicas da região. Utilizamos uma combinação de dissociação enzimática e mecânica para isolar células totais do pulmão e da traqueia. Células progenitoras específicas foram então fracionadas das células de origem proximal ou distal usando fluorescência de classificação celular associada (FACS) com base em marcadores de superfície específicos do tipo celular, como NGFR para classificação de células basais e HTII-280 para classificação de células alveolares tipo II. Progenitores basais isolados ou alveolares tipo II foram utilizados para gerar culturas organoides 3D. Tanto progenitores distal quanto proximal formaram organoides com uma colônia formando eficiência de 9-13% na região distal e 7-10% na região proximal quando banhados 5000 células/poços no dia 30. Organoides distais mantiveram células alveolares tipo II HTII-280+ na cultura, enquanto organoides proximais se diferenciaram em células ciliadas e secretary até o dia 30. Essas culturas organoides 3D podem ser utilizadas como uma ferramenta experimental para estudar a biologia celular das interações mesenquimais pulmonares e epiteliais, bem como para o desenvolvimento e validação de estratégias terapêuticas voltadas à disfunção epitelial em uma doença.

Introduction

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Os espaços aéreos do sistema respiratório humano podem ser amplamente divididos em zonas de condução e respiratória que mediam o transporte de gases e sua subsequente troca através da barreira epitelial-microvascular, respectivamente. As vias aéreas condutoras incluem traqueia, brônquios, brônquios e brônquios terminais, enquanto os espaços de ar respiratório incluem brônquios respiratórios, dutos alveolares e alvéolos. O revestimento epitelial desses espaços aéreos muda na composição ao longo do eixo proximo-distal para acomodar os requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. O epitélio pseudoesstratificado das vias aéreas traqueo-brônquico é composto por ....

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Protocol

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O tecido pulmonar humano foi obtido de doadores de tecidos falecidos em conformidade com os procedimentos de consentimento desenvolvidos pelo International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) e aprovados pelo Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.

1. Processamento de tecidos para isolamento de células pulmonares das regiões traqueo-brônquica ou pequenas vias aéreas/parenchymal (pequenas vias aéreas e alvéolos)

  1. Prepare e autoclave todos os instrumentos de dissecção, vidros e as soluções apropriadas um dia antes do isolamento celular.
  2. Ao receber tecido pulmonar, identifique e separe as regiões prox....

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Results

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Tecido pulmonar de origem
A traqueia e o brônquio extrapulmonar (Figura 1A) foram usados como tecido fonte para o isolamento de células epiteliais das vias aéreas proximais e posterior geração de organoides proximais. O tecido pulmonar distal que inclui tanto o parenchyma quanto as pequenas vias aéreas com menos de 2 mm de diâmetro (Figura 1A) foram utilizados para o isolamento de pequenas vias aéreas e células epiteliais alveolares (epitélio.......

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Discussion

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Descrevemos um método confiável para o isolamento de subpopulações definidas de células pulmonares do tecido pulmonar humano para análise molecular ou funcional e modelagem de doenças. Elementos críticos dos métodos incluem a capacidade de alcançar a dissociação tecidual com a preservação de epítopos superficiais, que permitem o enriquecimento mediado por anticorpos de células recém-isoladas, e a otimização de métodos culturais para a geração eficiente de organoides epiteliais específicos da região. Focamos na recuperaçã.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o apoio de Mizuno Takako para a coloração do IFC e H e E, Vanessa Garcia para seção de tecidos e Anika S Chandrasekaran por ajudar na preparação do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) e Consórcio Celgene IDEAL.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Isolamento celular
Seringas estéreis de 10 mL, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
Seringas estéreis de 30 mL, Luer-Lok TipVWRBD302832
Sacos de risco biológicoVWR89495-440
Sacos de risco biológicoVWR89495-440
anel de conexãoPluriselect41-50000-03
Deoxyribonuclease (lote#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Placas de Petri descartáveisCorning/Falcon25373-187
FunilPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Grau de Pesquisasigma Aldrich5401127001
agulha 16GVWR305198
agulha 18GVWR305199
PluriStrainer 100 µ m (Filtro de Células)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 µ m (Filtro de Células)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 µ m (Cell Strainer)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 µ m (Cell Strainer)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 µ m (Filtro de células)Pluriselect43-50070-51
Lâminas de barbearVWR55411-050
Tampão de lise de glóbulos vermelhoseBioscience00-4333-57
Equipamento ' s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Processador
LS ColunasMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Buffer
Anfotericina BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, livre de RNaseThermo fisher scientificAM9260G500µ l
Soro bovino fetalGemini Bio-Products100-10610ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456Frasco de 500ml
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (PSN) Mistura antibióticaThermo fisher scientific156400555ml
Lista de anticorpos para FACS
Alexa Fluor 647 anti-humano CD326 (EpCAM) AnticorpoBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Conjunto de partículas de controle negativoFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, humanoMiltenyi Biotec130-091-93520µ l/ 107 células totais
CD45 MicroBeads, humanoMiltenyi Biotec130-045-80120µ l/ 107 células totais
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-humano CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-humano CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-humano CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-camundongo IgM AnticorpoBioLegend4065061:500
Camundongo IgM anti humano HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anti-humano CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Composição de Meios
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MédioStemcell Technologies5001
Via Aérea Pequena Epitelial Meio de Crescimento CelularPromoCellC-21170
ThinCert Inserções de Cultura de Tecidos, Greiner EstérilBio-One662641
Y-27632 (inibidor de ROCK) estoque de 100mM (1000x)Stemcell Technologies72302
Meio
Anfotericina BThermo Fisher Scientific1529001850 µ l
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
de soro fetal bovinoGemini Bio-Products100-1065 ml
de insulina-transferrina-selênio (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 µ l
Mistura de Antibiótico Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (PSN)Thermo fisher scientific15640055500 µ l
SB431542 TGF-β inibidor da via (estoque 100 mM)Célula-tronco722345 µ l
Lista de anticorpos para solução
, à base de ácido cítricoVectorH-3300937 µ l em 100ml de água
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Anticorpos
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Anticorpo Monoclonal (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Uteroglobina/SCGB1A1 Humano AnticorpoR e D sistemasMAB42181:300
Queratina 5 Anticorpo Policlonal de Frango, Purificado [Poly9059]Biolegend9059011:500
MUC5AC Anticorpo Monoclonal (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Anticorpo Podoplanina (clone 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Purificado Mouse Anti-E-CaderinaBD biosciences6101821:1000
Sox-2 AnticorpoSanta Cruz biotechnologiessc-3659641:300
Anticorpos
Burro anti-coelho lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC anti-camundongo IgM AnticorpoBioLegend4065061:500
Cabra anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG1 anti-rato de cabra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG2a de cabra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG2a anti-rato de cabra, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Anticorpo Secundário de Imuno-Absorção Cruzada IgG2b Anti-Rato de Cabra, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211441:500
Buffers
Solução3% BSA, o.4% Triton-x100 em TBS (solução salina à base de Tris)
Solução3% BSA, ).1% Triton-X100 em TBS
SoluçãoTBS com 0,1% Tween 20
de tecidosde Cultura Organoide basal de camundongo: de desmascaramento de antígeno imuno-histoquímicaPrimáriossecundários de Bloqueio de Imuno-histoquímica de Incubação de Imuno-histoquímica de lavagem de imuno-histoquímica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.

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Lung Epithelial Progenitor CellsOrganoid CultureFluorescence Activated Cell SortingTissue DissociationCell Surface MarkersNGFR Basal CellsHTII 280 Alveolar CellsMagnetic Bead DepletionColony Forming Efficiency3D Organoid Generation

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