Isolering og berigelse af humane lungeepitelceller til organoidkultur
Summary
Denne artikel indeholder en detaljeret metode til vævsdissociation og cellulære fraktioneringsmetoder, der muliggør berigelse af levedygtige epitelceller fra proksimale og distale regioner i den menneskelige lunge. Heri anvendes disse tilgange til funktionel analyse af lungeepitelprogenitorceller ved brug af 3D-organoidkulturmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller tjener som værdifulde værktøjer til at studere den grundlæggende biologi i et organsystem og til sygdomsmodellering. Når de dyrkes som organoider, kan epitelprogenitorceller selvfornye og generere differentierende afkom, der udviser cellulære funktioner svarende til deres in vivo-modstykker . Heri beskriver vi en trin-for-trin protokol til at isolere regionsspecifikke forfædre fra menneskelig lunge og generere 3D-organoidkulturer som et eksperimentelt og valideringsværktøj. Vi definerer proksimale og distale regioner i lungen med det formål at isolere regionsspecifikke stamceller. Vi brugte en kombination af enzymatisk og mekanisk dissociation til at isolere totalceller fra lungen og luftrøret. Specifikke stamceller blev derefter fraktioneret fra de proksimale eller distale oprindelsesceller ved anvendelse af fluorescensassocieret cellesortering (FACS) baseret på celletypespecifikke overflademarkører, såsom NGFR til sortering af basalceller og HTII-280 til sortering af alveolære type II-celler. Isolerede basale eller alveolære type II forfædre blev brugt til at generere 3D-organoidkulturer. Både distale og proksimale forfædre dannede organoider med en kolonidannende effektivitet på 9-13% i distal region og 7-10% i proksimal region, når de blev belagt 5000 celle / brønd på dag 30. Distale organoider opretholdt HTII-280+ alveolære type II-celler i kultur, mens proksimale organoider differentierede sig til cilierede og sekretoriske celler på dag 30. Disse 3D-organoidkulturer kan bruges som et eksperimentelt værktøj til at studere cellebiologien af lungeepitel og epitelmesenkymale interaktioner samt til udvikling og validering af terapeutiske strategier rettet mod epitel dysfunktion i en sygdom.
Introduction
Luftrum i det menneskelige åndedrætssystem kan bredt opdeles i ledende og respiratoriske zoner, der formidler transport af gasser og deres efterfølgende udveksling over henholdsvis epitel-mikrovaskulær barriere. De ledende luftveje omfatter luftrør, bronchi, bronchioler og terminale bronchioler, mens respiratoriske luftrum omfatter respiratoriske bronchioler, alveolære kanaler og alveoler. Epitelforingen af disse luftrum ændrer sig i sammensætning langs den proximo-distale akse for at imødekomme de unikke krav i hver funktionelt særskilt zone. Det pseudostratificerede epitel af tracheo-bronchiale luftveje består af tre hovedcelletyper, basal, sekretorisk og cilieret, ud over de mindre rigelige celletyper, herunder børste, neuroendokrine og ionocyt 1,2,3. Bronchiolære luftveje har morfologisk lignende epitelcelletyper, selv om der er forskelle i deres overflod og funktionelle egenskaber. For eksempel er basalceller mindre rigelige inden for bronchiolære luftveje, og sekretoriske celler omfatter en større andel af klubceller versus serøse og bægerceller, der dominerer i tracheo-bronchiale luftveje. Epitelceller i åndedrætszonen indbefatter en dårligt defineret kuboidcelletype i respiratoriske bronchioler ud over alveolære type I (ATI) og type II (ATII) celler af alveolære kanaler og alveoler 1,4.
Identiteten af epitelstamme- og stamcelletyper, der bidrager til vedligeholdelse og fornyelse af epitel i hver zone, er ufuldstændigt beskrevet og i vid udstrækning udledt af undersøgelser i dyremodeller 5,6,7,8. Undersøgelser på mus har vist, at enten basalceller i pseudostratificerede luftveje eller klubceller i bronchiolære luftveje eller ATII-celler i det alveolære epitel tjener som epitelstamceller baseret på kapacitet til ubegrænset selvfornyelse og multipotent differentiering 7,9,10,11,12 . På trods af manglende evne til at udføre genetiske afstamningsundersøgelser for at vurdere stammeligheden af humane lungeepitelcelletyper, giver tilgængeligheden af organoidbaserede kulturmodeller til vurdering af det funktionelle potentiale af epitelstamme- og stamcelleceller et værktøj til sammenlignende undersøgelser mellem mus og human 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder til isolering af epitelcelletyper fra forskellige regioner i den menneskelige lunge og deres kultur ved hjælp af et 3D-organoidsystem til at rekapitulere de regionale celletyper. Lignende metoder er udviklet til funktionel analyse og sygdomsmodellering af epitelceller fra andre organsystemer 18,19,20,21. Disse metoder giver en platform til identifikation af regionale epitelprogenitorceller, til at udføre mekanistiske undersøgelser, der undersøger deres regulering og mikromiljø, og for at muliggøre sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse. Selvom undersøgelser af lungeepitelceller udført i dyremodeller kan drage fordel af analysen, enten in vivo eller in vitro, har indsigt i identiteten af humane lungeepitelprogenitorceller i høj grad været afhængig af ekstrapolering fra modelorganismer. Som sådan giver disse metoder en bro til at relatere identiteten og adfærden af humane lungeepitelcelletyper med deres undersøgelser, der undersøger regulering af stam- / stamcelleceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en pålidelig metode til isolering af definerede underpopulationer af lungeceller fra humant lungevæv til enten molekylær eller funktionel analyse og sygdomsmodellering. Kritiske elementer i metoder omfatter evnen til at opnå vævsdissociation med bevarelse af overfladeepitoper, som tillader antistofmedieret berigelse af frisk isolerede celler og optimering af kulturmetoder til effektiv dannelse af regionsspecifikke epitelorganoider. Vi fokuserer på genopretning og berigelse af epitelprogenitorceller, de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på støtte fra Mizuno Takako til IFC og H og E farvning, Vanessa Garcia til vævssektionering og Anika S Chandrasekaran til at hjælpe med manuskriptforberedelse. Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) og Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
