オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮
Summary
本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。
Abstract
上皮オルガノイドモデルは、臓器系の基本的な生物学を研究し、疾患モデリングのための貴重なツールとして役立ちます。オルガノイドとして増殖すると、上皮前駆細胞は自己更新し、 in vivo 対応物と同様の細胞機能を示す分化後代を生成することができる。本明細書では、ヒト肺から領域特異的前駆細胞を単離し、実験および検証ツールとして3Dオルガノイド培養物を生成するための段階的なプロトコルについて説明します。我々は、領域特異的前駆細胞を単離することを目標として、肺の近位領域および遠位領域を定義する。酵素的解離と機械的解離の組み合わせを利用して、肺と気管から全細胞を単離しました。次いで、基底細胞を選別するためのNGFRおよび肺胞II型細胞を選別するためのHTII−280などの細胞型特異的表面マーカーに基づく蛍光関連細胞選別(FACS)を用いて、近位または遠位起源細胞から特異的前駆細胞を分画した。単離された基底または肺胞II型前駆細胞を用いて、3Dオルガノイド培養物を作製した。遠位および近位前駆細胞の両方が、30日目に5000細胞/ウェルを播種した場合、遠位領域で9〜13%、近位領域で7〜10%のコロニー形成効率を有するオルガノイドを形成した。遠位オルガノイドはHTII-280+ 肺胞II型細胞を培養中に維持したが、近位オルガノイドは30日目までに繊毛細胞および分泌細胞に分化した。これらの3Dオルガノイド培養は、肺上皮と上皮間葉相互作用の細胞生物学を研究するための実験ツールとして、ならびに疾患における上皮機能障害を標的とする治療戦略の開発および検証のために使用することができる。
Introduction
ヒト呼吸器系の空域は、ガスの輸送およびそれに続く上皮 – 微小血管障壁を横切るそれらの交換をそれぞれ媒介する伝導ゾーンおよび呼吸ゾーンに大別することができる。伝導気道には気管、気管支、細気管支および末期細気管支が含まれ、呼吸空気空間には呼吸細気管支、肺胞管および肺胞が含まれる。これらの空域の上皮ライニングは、機能的に異なる各ゾーンの固有の要件に対応するために、近位 – 遠位軸に沿った組成の変化。気管気管気道の偽層化上皮は、ブラシ、神経内分泌およびイオノサイトを含むあまり豊富ではない細胞型に加えて、基底、分泌および繊毛の3つの主要な細胞型からなる1,2,3。細気管支気道は形態学的に類似した上皮細胞型を有するが、その豊富さと機能的特性には区別がある。例えば、基底細胞は細気管支気道内ではあまり存在せず、分泌細胞は、気管気管支気道において優勢な漿液性および杯細胞と比較して、クラブ細胞の割合が高い。 呼吸帯の上皮細胞は、肺胞管および肺胞のI型(ATI)およびII型(ATII)細胞に加えて、呼吸器細気管支における定義が不十分な直方体細胞型を含む1,4。
各ゾーンにおける上皮の維持および再生に寄与する上皮幹および前駆細胞型の同一性は、不完全に記載されており、動物モデル5、6、7、8の研究から大部分が推測される。マウスにおける研究は、偽層化気道の基底細胞、または細気管支気道のクラブ細胞または肺胞上皮のATII細胞のいずれかが、無制限の自己複製および多能性分化の能力に基づいて上皮幹細胞として機能することを示している7,9,10,11,12 .ヒト肺上皮細胞型の幹性を評価するための遺伝的系統追跡研究を行うことができないにもかかわらず、上皮幹および前駆細胞の機能的可能性を評価するためのオルガノイドベースの培養モデルの利用可能性は、マウスとヒトとの間の比較研究のためのツールを提供する13,14,15,16,17。
我々は、ヒト肺の異なる領域から上皮細胞型を単離し、その培養物を3Dオルガノイド系を用いて局所細胞型を要約する方法について記載する。同様の方法が、他の器官系からの上皮細胞の機能解析および疾患モデリングのために開発されている18、19、20、21。これらの方法は、局所上皮前駆細胞の同定のためのプラットフォームを提供し、それらの調節および微小環境を調査する機構的研究を実行し、疾患モデリングおよび創薬を可能にする。動物モデルで行われた肺上皮前駆細胞の研究は、in vivoまたはin vitroのいずれかで解析の恩恵を受けることができますが、ヒト肺上皮前駆細胞の同一性に関する洞察は、モデル生物からの外挿に大きく依存しています。このように、これらの方法は、ヒト肺上皮細胞型の同一性および挙動を、幹/前駆細胞の調節を調査する研究と関連付けるための橋渡しを提供する。
Protocol
ヒト肺組織は、国際医学振興研究所(IIAM)が開発し、シダーズ・シナイ医療センター内部審査委員会によって承認された同意手順に従って、死亡した組織ドナーから入手した。 1. 気管気管支または小気道/実質(小気道および肺胞)領域から肺細胞を単離するための組織処理 細胞単離の1日前に、すべての解剖器具、ガラス製品、および適切な溶液を準備してオートク?…
Representative Results
ソース肺組織気管および肺外気管支(図1A)を、近位気道上皮細胞の単離およびその後の近位オルガノイドの生成のための供給源組織として使用した。実質および直径2mm未満の小さな気道の両方を含む遠位肺組織(図1A)を、小さな気道および肺胞上皮細胞(遠位肺上皮)の単離および小気道または肺胞オルガノイドの生成に使用した。偽層…
Discussion
我々は、分子的または機能的解析および疾患モデリングのために、ヒト肺組織から肺細胞の定義された部分集団を単離するための信頼できる方法を説明する。方法の重要な要素には、新たに単離された細胞の抗体媒介濃縮を可能にする表面エピトープの保存による組織解離を達成する能力、および領域特異的上皮オルガノイドの効率的な生成のための培養方法の最適化が含まれる。我々は、?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IFCおよびHおよびE染色の水野貴子、組織切片のヴァネッサ・ガルシア、原稿作成の支援に対するアニカ・S・チャンドラセカランのサポートに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(5RO1HL135163-04、PO1HL108793-08)とセルジーンIDEALコンソーシアムによってサポートされています。
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
Citar este artigo
Konda, B., Mulay, A., Yao, C., Beil, S., Israely, E., Stripp, B. R. Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture. J. Vis. Exp. (161), e61541, doi:10.3791/61541 (2020).