이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.
상피 오가노이드 모델은 장기 시스템의 기본 생물학을 연구하고 질병 모델링을 연구하는 데 유용한 도구 역할을합니다. 오가노이드로서 성장할 때, 상피 전구 세포는 생체 내 대응물과 유사한 세포 기능을 나타내는 분화 자손을 스스로 갱신하고 생성할 수 있다. 여기에서 우리는 인간 폐에서 지역 특정 선조를 분리하고 실험 및 검증 도구로서 3D 오가노이드 배양물을 생성하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 우리는 영역 특이적 전구 세포를 분리하는 것을 목표로 폐의 근위 및 원위 영역을 정의합니다. 우리는 폐와 기관으로부터 전체 세포를 분리하기 위해 효소 및 기계적 해리의 조합을 이용했습니다. 이어서, 특정 전구 세포를 기저 세포를 분류하기 위한 NGFR 및 폐포 유형 II 세포를 분류하기 위한 HTII-280과 같은 세포 유형 특이적 표면 마커에 기초한 형광 관련 세포 분류 (FACS)를 사용하여 근위 또는 원위 기원 세포로부터 분획화하였다. 분리된 기저 또는 폐포 유형 II 전구물질을 사용하여 3D 오가노이드 배양물을 생성하였다. 원위 및 근위 선조는 모두 30 일째에 5000 세포 / 웰을 도금 할 때 원위 영역에서 9-13 %, 근위 영역에서 7-10 %의 콜로니 형성 효율을 가진 오가노이드를 형성했습니다. 원위 오가노이드는 배양물에서 HTII-280+ 폐포 유형 II 세포를 유지한 반면, 근위 오가노이드는 30일째까지 섬모 및 분비 세포로 분화되었다. 이러한 3D 오가노이드 배양은 폐 상피 및 상피 중간엽 상호작용의 세포 생물학을 연구하기 위한 실험 도구로서뿐만 아니라, 질병에서 상피 기능장애를 표적으로 하는 치료 전략의 개발 및 검증을 위한 실험 도구로 사용될 수 있다.
인간 호흡 시스템의 공역은 크게 가스의 수송과 상피 – 미세 혈관 장벽을 가로 지르는 후속 교환을 매개하는 전도 구역과 호흡 영역으로 나눌 수 있습니다. 전도 기도에는 기관지, 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지가 포함되며 호흡기 공기 공간에는 호흡기 세기관지, 폐포관 및 폐포가 포함됩니다. 이러한 영공의 상피 라이닝은 각 기능적으로 구별되는 구역의 고유한 요구 사항을 수용하기 위해 근위축을 따라 구성이 바뀝니다. 기관지 기도의 의사 층화 상피는 브러시, 신경 내분비 및 이온성 세포 1,2,3을 포함한 덜 풍부한 세포 유형 외에도 기저, 분비 및 섬모의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. Bronchiolar 기도는 형태학적으로 유사한 상피 세포 유형을 가지고 있지만, 풍부함과 기능적 특성에는 구별이 있습니다. 예를 들어, 기저 세포는 기관지 기도 내에 덜 풍부하며, 분비 세포는 기관지-기관지 기도에서 우세한 장액성 및 잔 세포에 비해 클럽 세포의 더 큰 비율을 포함한다. 호흡 영역의 상피 세포는 폐포관 및 폐포 1,4의 폐포 유형 I (ATI) 및 유형 II (ATII) 세포 이외에 호흡 세기관지에서 잘못 정의된 입방체 세포 유형을 포함한다.
각 구역에서 상피의 유지 및 재생에 기여하는 상피 줄기 및 전구 세포 유형의 동일성은 불완전하게 기술되고 동물 모델 5,6,7,8의 연구로부터 크게 추론된다. 생쥐에 대한 연구에 따르면 의사 층화 된 기도의 기저 세포 또는 기관지 기도의 클럽 세포 또는 폐포 상피의 ATII 세포는 무제한의 자기 재생 및 분화 능력을 기반으로 상피 줄기 세포 역할을한다는 것을 보여주었습니다 7,9,10,11,12 . 인간 폐 상피 세포 유형의 줄기를 평가하기 위해 유전 적 혈통 추적 연구를 수행 할 수 없음에도 불구하고, 상피 줄기 및 전구 세포의 기능적 잠재력을 평가하기위한 오가노이드 기반 배양 모델의 가용성은 마우스와 인간 13,14,15,16,17 사이의 비교 연구를위한 도구를 제공합니다.
우리는 인간 폐의 다른 영역에서 상피 세포 유형을 분리하는 방법과 지역 세포 유형을 재조정하기 위해 3D 오가노이드 시스템을 사용하여 배양하는 방법을 설명합니다. 유사한 방법들이 다른 기관 시스템들로부터의 상피 세포의 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 개발되었다 18,19,20,21. 이러한 방법은 지역 상피 전구 세포의 확인, 그들의 조절 및 미세 환경을 조사하는 기계론적 연구를 수행하고, 질병 모델링 및 약물 발견을 가능하게하는 플랫폼을 제공합니다. 동물 모델에서 수행된 폐 상피 전구 세포에 대한 연구가 생체내 또는 시험관내 분석으로부터 이익을 얻을 수 있음에도 불구하고, 인간 폐 상피 전구 세포의 동일성에 대한 통찰력은 모델 유기체로부터의 외삽에 크게 의존해 왔다. 따라서 이러한 방법은 인간 폐 상피 세포 유형의 정체성과 행동을 줄기 / 전구 세포의 조절을 조사하는 연구와 관련시키는 다리를 제공합니다.
우리는 분자 또는 기능적 분석 및 질병 모델링을 위해 인간 폐 조직으로부터 폐 세포의 정의 된 하위 집단을 분리하기위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 방법의 중요한 요소에는 갓 분리된 세포의 항체 매개 농축을 허용하는 표면 에피토프의 보존과 함께 조직 해리를 달성하는 능력, 및 영역 특이적 상피 오가노이드의 효율적인 생성을 위한 배양 방법의 최적화가 포함된다. 우리는 입체 배양…
The authors have nothing to disclose.
IFC 및 H 및 E 염색을 위한 Mizuno Takako, 조직 절편을 위한 Vanessa Garcia, 원고 준비를 도와준 Anika S Chandrasekaran의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) 및 Celgene IDEAL 컨소시엄의 지원을 받습니다.
Cell Isolation | |||
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
HBSS | Corning | 21-023 | |
Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
needle 16G | VWR | 305198 | |
needle 18G | VWR | 305199 | |
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
Equipment’s | |||
GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
Leica ASP 300s Tissue processor | |||
LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
HBSS+ Buffer | |||
Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
List of antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
Composition of Organoid Culture mediums | |||
MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
Mouse Basal medium: | |||
Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
Primary Antibodies | |||
Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
Buffers | |||
Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |