Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры
Summary
В данной статье представлена подробная методология диссоциации тканей и клеточного фракционирования, позволяющая обогатить жизнеспособные эпителиальные клетки из проксимальных и дистальных областей легкого человека. При этом эти подходы применяются для функционального анализа клеток-предшественников эпителия легких с помощью 3D-моделей культур органоидов.
Abstract
Эпителиальные органоидные модели служат ценными инструментами для изучения базовой биологии системы органов и для моделирования заболеваний. При выращивании в качестве органоидов эпителиальные клетки-предшественники могут самообновляться и генерировать дифференцированное потомство, которое проявляет клеточные функции, аналогичные функциям их аналогов in vivo . Здесь мы описываем пошаговый протокол для выделения региональных предшественников из легких человека и создания 3D-органоидных культур в качестве экспериментального и валидационного инструмента. Мы определяем проксимальные и дистальные области легкого с целью выделения областно-специфических клеток-предшественников. Мы использовали комбинацию ферментативной и механической диссоциации для выделения общих клеток из легких и трахеи. Специфические клетки-предшественники затем фракционировали из клеток проксимального или дистального происхождения с использованием флуоресцентной ассоциированной сортировки клеток (FACS) на основе специфических поверхностных маркеров типа клеток, таких как NGFR для сортировки базальных клеток и HTII-280 для сортировки альвеолярных клеток типа II. Изолированные базальные или альвеолярные предшественники типа II использовались для генерации 3D органоидных культур. Как дистальные, так и проксимальные предшественники образовывали органоиды с колониеобразующей эффективностью 9-13% в дистальной области и 7-10% в проксимальной области при покрытии 5000 клеток/колодец на 30 день. Дистальные органоиды поддерживали альвеолярные клетки HTII-280+ типа II в культуре, тогда как проксимальные органоиды дифференцировались в реснитчатые и секреторные клетки к 30-му дню. Эти 3D органоидные культуры могут быть использованы в качестве экспериментального инструмента для изучения клеточной биологии эпителия легких и эпителиальных мезенхимальных взаимодействий, а также для разработки и валидации терапевтических стратегий, направленных на эпителиальную дисфункцию при заболевании.
Introduction
Воздушное пространство дыхательной системы человека можно в широком смысле разделить на проводящую и дыхательную зоны, опосредующие перенос газов и их последующий обмен через эпителиально-микрососудистый барьер соответственно. Проводящие дыхательные пути включают трахею, бронхи, бронхиолы и терминальные бронхиолы, тогда как дыхательные воздушные пространства включают дыхательные бронхиолы, альвеолярные протоки и альвеолы. Эпителиальная оболочка этих воздушных пространств изменяется в составе вдоль проксимо-дистальной оси, чтобы удовлетворить уникальные требования каждой функционально отдельной зоны. Псевдостратифицированный эпителий трахео-бронхиальных дыхательных путей состоит из трех основных типов клеток, базальных, секреторных и реснитчатых, в дополнение к менее распространенным типам клеток, включая щетку, нейроэндокрин и ионоцит 1,2,3. Бронхиолярные дыхательные пути содержат морфологически сходные типы эпителиальных клеток, хотя существуют различия в их обилии и функциональных свойствах. Например, базальные клетки менее распространены в бронхиолярных дыхательных путях, а секреторные клетки включают большую долю клубных клеток по сравнению с серозными и бокаловидными клетками, которые преобладают в трахео-бронхиальных дыхательных путях. Эпителиальные клетки дыхательной зоны включают плохо выраженный кубоидальный тип клеток в дыхательных бронхиолах, в дополнение к альвеолярным клеткам I типа (ATI) и типу II (ATII) альвеолярных протоков и альвеол 1,4.
Идентичность типов эпителиальных стволовых и клеток-предшественников, способствующих поддержанию и обновлению эпителия в каждой зоне, описана не полностью и в значительной степени выведена из исследований на животных моделях 5,6,7,8. Исследования на мышах показали, что либо базальные клетки псевдостратифицированных дыхательных путей, либо клубные клетки бронхиолярных дыхательных путей, либо ATII клетки альвеолярного эпителия служат эпителиальными стволовыми клетками, основанными на способности к неограниченному самообновлению и мультипотентной дифференцировке 7,9,10,11,12 . Несмотря на невозможность проведения исследований по отслеживанию генетической линии для оценки стволовых типов эпителиальных клеток легких человека, наличие моделей культур на основе органоидов для оценки функционального потенциала эпителиальных стволовых и клеток-предшественников обеспечивает инструмент для сравнительных исследований между мышью и человеком 13,14,15,16,17.
Описаны методы выделения типов эпителиальных клеток из различных областей легкого человека и их культивирования с использованием 3D-органоидной системы для рекапитуляции региональных типов клеток. Аналогичные методы были разработаны для функционального анализа и моделирования заболеваний эпителиальных клеток из других систем органов 18,19,20,21. Эти методы обеспечивают платформу для идентификации региональных эпителиальных клеток-предшественников, для проведения механистических исследований, изучающих их регуляцию и микроокружение, а также для моделирования заболеваний и открытия лекарств. Несмотря на то, что исследования клеток-предшественников эпителия легких, выполненные на животных моделях, могут извлечь выгоду из анализа, либо in vivo, либо in vitro, понимание идентичности клеток-предшественников эпителия легких человека в значительной степени зависит от экстраполяции от модельных организмов. Таким образом, эти методы обеспечивают мост для связи идентичности и поведения типов эпителиальных клеток легких человека с их исследованиями, изучающими регуляцию стволовых / предшественников клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан надежный метод выделения определенных субпопуляций клеток легких из легочной ткани человека для молекулярного или функционального анализа и моделирования заболеваний. К критическим элементам методов относятся способность достигать диссоциации тканей с сохранением поверхно…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы ценим поддержку со стороны Мидзуно Такако в окрашивании IFC и H и E, Ванессы Гарсия в секционировании тканей и Аники С. Чандрасекаран за помощь в подготовке рукописи. Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) и консорциумом Celgene IDEAL.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
