Isolering och anrikning av humana lungepitelceller för organoidkultur
Summary
Denna artikel ger en detaljerad metod för vävnadsdissociation och cellulär fraktioneringsmetoder som möjliggör anrikning av livskraftiga epitelceller från proximala och distala regioner i den mänskliga lungan. Häri tillämpas dessa tillvägagångssätt för funktionell analys av lungepitelceller genom användning av 3D-organoider odlingsmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller fungerar som värdefulla verktyg för att studera den grundläggande biologin i ett organsystem och för sjukdomsmodellering. När de odlas som organoider kan epiteliala stamceller självförnya och generera differentierande avkomma som uppvisar cellulära funktioner som liknar deras in vivo-motsvarigheter . Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för att isolera regionspecifika förfäder från mänsklig lunga och generera 3D-organoidkulturer som ett experimentellt och valideringsverktyg. Vi definierar proximala och distala regioner i lungan med målet att isolera regionspecifika stamceller. Vi använde en kombination av enzymatisk och mekanisk dissociation för att isolera totala celler från lungan och luftstrupen. Specifika stamceller fraktionerades sedan från de proximala eller distala ursprungscellerna med hjälp av fluorescensassocierad cellsortering (FACS) baserat på celltypspecifika ytmarkörer, såsom NGFR för sortering av basalceller och HTII-280 för sortering av alveolära typ II-celler. Isolerade basala eller alveolära typ II-förfäder användes för att generera 3D-organoidkulturer. Både distala och proximala förfäder bildade organoider med en kolonibildande effektivitet på 9-13% i distal region och 7-10% i proximal region när de pläterades 5000 celler / brunn på dag 30. Distala organoider upprätthöll HTII-280+ alveolära typ II-celler i odling medan proximala organoider differentierades till cilierade och sekretoriska celler vid dag 30. Dessa 3D-organoidkulturer kan användas som ett experimentellt verktyg för att studera cellbiologin för lungepitel och epitelial mesenkymala interaktioner, samt för utveckling och validering av terapeutiska strategier riktade mot epitelial dysfunktion i en sjukdom.
Introduction
Luftrum i det mänskliga andningsorganen kan i stort sett delas in i ledande och andningszoner som förmedlar transport av gaser och deras efterföljande utbyte över den epitel-mikrovaskulära barriären. De ledande luftvägarna inkluderar luftstrupen, bronkierna, bronkiolerna och terminala bronkioler, medan andningsluftutrymmen inkluderar andningsbronkioler, alveolära kanaler och alveoler. Epitelfodret i dessa luftrum förändras i sammansättning längs den proximo-distala axeln för att tillgodose de unika kraven i varje funktionellt distinkt zon. Det pseudostratifierade epitelet av trakeo-bronkial luftvägar består av tre huvudcelltyper, basala, sekretoriska och cilierade, förutom de mindre rikliga celltyperna inklusive borste, neuroendokrin och jonocyt 1,2,3. Bronchiolar airways har morfologiskt liknande epitelcelltyper, även om det finns skillnader i deras överflöd och funktionella egenskaper. Till exempel är basala celler mindre rikliga i bronkiolära luftvägar, och sekretoriska celler inkluderar en större andel klubbceller jämfört med serösa och bägare celler som dominerar i trakeo-bronkial luftvägar. Epitelceller i andningszonen innefattar en dåligt definierad kuboid celltyp i respiratoriska bronkioler, förutom alveolära typ I (ATI) och typ II (ATII) celler av alveolära kanaler och alveoler 1,4.
Identiteten hos epitelstam- och stamcellstyper som bidrar till underhåll och förnyelse av epitel i varje zon beskrivs ofullständigt och härleds till stor del från studier i djurmodeller 5,6,7,8. Studier på möss har visat att antingen basala celler i pseudostratifierade luftvägar eller klubbceller i bronkiolära luftvägar eller ATII-celler i det alveolära epitelet fungerar som epitelstamceller baserat på kapacitet för obegränsad självförnyelse och multipotent differentiering 7,9,10,11,12 . Trots oförmågan att utföra genetiska härstamningsspårningsstudier för att bedöma stamheten hos humana lungepitelcelltyper, ger tillgången till organoidbaserade odlingsmodeller för att bedöma den funktionella potentialen hos epitelstam- och stamceller ett verktyg för jämförande studier mellan mus och människa 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder för isolering av epitelcelltyper från olika regioner i den mänskliga lungan och deras odling med hjälp av ett 3D-organoidsystem för att rekapitulera de regionala celltyperna. Liknande metoder har utvecklats för funktionell analys och sjukdomsmodellering av epitelceller från andra organsystem 18,19,20,21. Dessa metoder ger en plattform för identifiering av regionala epiteliala stamceller, för att utföra mekanistiska studier som undersöker deras reglering och mikromiljö och för att möjliggöra sjukdomsmodellering och läkemedelsupptäckt. Även om studier av lungepitelceller utförda i djurmodeller kan dra nytta av analysen, antingen in vivo eller in vitro, har insikter om identiteten hos humana lungepitelceller till stor del varit beroende av extrapolering från modellorganismer. Som sådan ger dessa metoder en bro för att relatera identiteten och beteendet hos humana lungepitelcelltyper med sina studier som undersöker reglering av stam- / stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en tillförlitlig metod för isolering av definierade subpopulationer av lungceller från mänsklig lungvävnad för antingen molekylär eller funktionell analys och sjukdomsmodellering. Kritiska element i metoder inkluderar förmågan att uppnå vävnadsdissociation med bevarande av ytepitoper, vilket möjliggör antikroppsmedierad anrikning av nyligen isolerade celler och optimering av odlingsmetoder för effektiv generering av regionspecifika epitelorganoider. Vi fokuserar på återhämtning och anrikning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppskattar stöd från Mizuno Takako för IFC- och H- och E-färgning, Vanessa Garcia för vävnadssektionering och Anika S Chandrasekaran för att hjälpa till med manuskriptberedning. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) och Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Referências
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
