内在无序结构域对致癌融合转录因子功能很重要。为了治疗靶向这些蛋白质,需要更详细地了解这些结构域所采用的调节机制。在这里,我们使用转录组学来绘制尤文氏肉瘤中内在无序的EWS结构域的重要结构特征。
许多癌症的特征在于染色体易位,导致致癌融合转录因子的表达。通常,这些蛋白质包含与另一种蛋白质的DNA结合结构域(DBD)融合的内在无序结构域(IDD),并协调广泛的转录变化以促进恶性肿瘤。这些融合通常是它们引起的癌症中唯一反复出现的基因组畸变,使它们成为有吸引力的治疗靶点。然而,靶向致癌转录因子需要更好地了解低复杂性IDD在其功能中所起的机制作用。EWSR1 的 N 端结构域是一种 IDD,涉及多种致癌融合转录因子,包括 EWS/FLI、EWS/ATF 和 EWS/WT1。在这里,我们使用RNA测序来研究EWS结构域的结构特征,这些结构域对Ewing肉瘤中EWS / FLI的转录功能很重要。首先进行shRNA介导的尤文氏肉瘤细胞内源性融合的消耗,该细胞与各种EWS突变体构建体的异位表达配对。然后使用RNA测序来分析表达这些构建体的细胞的转录组,以表征与EWS结构域突变相关的功能缺陷。通过将转录组学分析与先前发表的有关EWS / FLI DNA结合基序和基因组定位的信息以及转化能力的功能测定相结合,我们能够确定对肿瘤发生重要的EWS / FLI的结构特征,并定义一组对尤文氏肉瘤至关重要的EWS / FLI靶基因。本文证明了使用RNA测序作为绘制致癌转录因子内在无序结构域的结构 – 功能关系的方法。
癌症的一个子集,包括许多儿童和青春期的恶性肿瘤,其特征在于染色体易位,产生新的融合癌基因1,2,3,4,5,6。由此产生的融合蛋白经常作为致癌转录因子起作用,协调转录调控的广泛变化以促进肿瘤发生7,8。具有这些易位的癌症通常具有安静的突变景观,除了特征性融合之外,很少有反复出现的基因组畸变4,9。因此,直接靶向融合蛋白是这些疾病中一种有吸引力的治疗策略。然而,这些致癌转录因子通常由低复杂性,内在无序,转录激活结构域与DNA结合结构域(DBD)融合10,11,12,13,14组成。这些蛋白质的内在无序结构域(IDD)和DBD都已被证明很难用传统的药理学方法靶向。因此,开发新的治疗方法需要更详细的分子理解这些融合所采用的机制,以异常地调节基因表达。
EWSR1的N端IDD部分通常融合到癌症中的DBD,包括尤文氏肉瘤中的EWS / FLI,弥漫性小圆细胞肿瘤中的EWS / WT1以及软部分10的透明细胞肉瘤中的EWS /ATF1。EWS IDD在每次聚变中的机制作用尚不清楚。EWS/ETS系列融合,特别是EWS/FLI,是迄今为止功能最突出的融合。EWS/ FLI协调全基因组表观遗传和转录变化,导致数千个基因的激活和抑制7,11,15,16。研究表明,IDD对于转录共激活子(如p300,WDR5和BAF复合物)以及共抑制子(如NuRD复合物)的招募很重要11,15,17。EWS IDD与FLI1的C端部分的融合赋予了FLI1的ETS DBD新的DNA结合特异性,使得融合癌蛋白(EWS / FLI)结合到基因组的重复GGAA-微卫星区域除了共识ETS基序18,19,20之外。结合共激活子募集功能,EWS/FLI的这种紧急DNA结合活性促进GGAA-微卫星远端到转录起始位点(TSS)(”增强子样”微卫星)的从头增强子形成,并招募RNA聚合酶II以促进在TSS(”启动子样”微卫星)近端的GGAA-微卫星(”启动子样”微卫星)的转录11,15,16,21。
综上所述,这些数据使我们假设EWS域内的离散元素有助于为不同类型的EWS / FLI结合位点招募不同的共同调节因子。然而,在EWS / FLI的EWS部分内辨别这些元素以及它们如何运作,受到该领域高度重复和无序性质的阻碍。在这里,我们利用先前在尤文氏肉瘤细胞中发表的敲低-拯救系统来功能性地绘制EWS IDD中的这些元素。在这个系统中,EWS / FLI使用靶向FLI1基因的3’UTR的shRNA耗尽,并且使用缺乏3’UTR7,17,22的不同EWS / FLI突变cDNA构建体来挽救表达。这些实验集中在具有各种缺失的构建体上,以绘制EWS IDD与重要致癌表型之间的结构 – 功能关系,包括GGAA-微卫星报告基因构建体的激活,集落形成测定以及EWS / FLI激活和抑制基因的靶向验证7,17,22.然而,这些研究未能在EWS / FLI的EWS IDD中发现离散子结构域,这些子结构域对于激活或抑制都非常重要。所有测试的构建体要么能够激活和抑制特定的靶基因,导致有效的菌落形成,要么无法调节任何EWS / FLI靶基因,导致菌落形成7,17,22的丧失。
通过广泛采用下一代测序实现的转录组学分析通常用于比较两种情况下的基因表达特征,通常在筛选或描述性研究的背景下。相反,我们希望利用使用RNA测序(RNA-seq)捕获全基因组表达数据的能力来表征IDD对转录因子功能的贡献。在这种情况下,RNA-seq与敲低-救援系统配对,以探索EWS结构域的结构-功能关系。这种方法适用于其他融合转录因子,包括其他EWS融合或功能知之甚少的野生型转录因子,并且与用于功能图谱研究的其他测定(例如报告测定或靶向qRT-PCR)相比具有多种优势。这些包括在相关染色质环境中测试功能的结构决定因素,在一次测定中测试多种类型的响应元件的能力(即,活化和抑制,GGAA-微卫星和非微卫星等),以及由此产生的更好地检测部分功能的能力。
这种方法的成功实施取决于基于细胞的系统,该系统捕获感兴趣的表型(在这种情况下,A673细胞具有shRNA介导的EWS / FLI耗尽),以及适合基于细胞的系统的表达载体中的一组突变体构建体(在这种情况下,pMSCV-hygro具有各种3x-FLAG标记的EWS / FLI突变体将通过逆转录病毒转导递送)。建议对基于CRISPR的耗竭构建体、基于shRNA的耗竭构建体和cDNA表达构建体进行病毒转导,并进行适当的选择以产生稳定的细胞系,而不是瞬时转染。当转录组学数据可以与转录因子定位相关的其他数据和其他表型读数(如果可用)配对时,结果的下游解释得到加强。
在本文中,我们应用这种方法来表征EWS / FLI14的DAF突变体的活性。DAF突变体在EWS / FLI 14的EWS IDD的重复区域中有17个酪氨酸至丙氨酸突变。这种特殊的EWS突变体以前曾被报道过,当与ATF1 DBD14融合时,它无法激活报告基因表达。然而,初步的qRT-PCR数据表明,该突变体能够激活EWS / FLI靶标 NR0B123的转录。这里描述的转录组学方法能够成功检测DAF突变体的部分功能。通过将这些转录组学数据与有关EWS / FLI结合和识别基序的信息配对,我们进一步表明DAF突变体在GGAA-微卫星重复时保持功能。这些结果将DAF确定为第一个部分功能的EWS / FLI突变体,并突出了非微卫星基因的功能对肿瘤发生很重要(如报道23)。这证明了这种转录组学结构 – 功能映射方法的强大功能,可以深入了解致癌转录因子的功能。
研究致癌转录因子的生化机制对于了解它们引起的疾病和设计新的治疗策略至关重要。在以染色体易位为特征的恶性肿瘤中尤其如此,导致融合转录因子。这些嵌合蛋白中包含的结构域可能与野生型蛋白质中存在的调节结构域缺乏有意义的相互作用,使在融合的背景下解释结构 – 功能信息的能力复杂化26,27,28。此外,许多这些致癌融合的特征是低复杂性的内在无序结构域10,13,29,30。
EWS结构域是这种本质无序结构域的一个例子,该域涉及各种致癌融合10。固有的无序性和重复性阻碍了理解EWS结构域所采用的分子机制的努力。先前研究结构 – 功能的努力在很大程度上诉诸于在报告基因测定的背景下或在细胞背景中使用不同的突变体,这些突变体无法概括相关的细胞背景,或者缺乏任何产生有意义的部分功能的结构变异11,17,25。此处介绍的方法解决了这些问题。在疾病相关细胞环境中进行结构-功能映射,下一代测序使转录组学谱分析能够在天然染色质的设置下评估转录因子功能。在EWS / FLI的DAF突变体的特定情况下,据报道DAF在使用分离的反应元件的报告基因测定中几乎没有活性,但在完整基因启动子的背景下显示活性,无论是在报告测定中还是在天然染色质中,都表明一个有趣的表型23。使用这里描述的方法更直接地解决了基因组中哪种类型的调节元件在疾病环境中反应最灵敏的问题。通过同时在其天然染色质环境中测试所有候选靶基因,转录组学方法更有可能识别具有部分功能的构建体。
使用与疾病相关的细胞背景的固有强度可能是这种技术的最大局限性。最重要的因素之一是为这些实验选择合适的细胞系统。许多来自具有特征性转录因子的恶性肿瘤的细胞系不容易耐受该转录因子的敲低,并且在许多情况下,特别是对于儿科癌症,真正的起源细胞仍然存在争议,并且癌基因在其他细胞背景中的表达是令人望而却步的毒性31,32 .在这些情况下,在不同的细胞背景中进行实验可能会有所帮助,只要研究人员在解释结果时要谨慎,并在更与疾病相关的细胞类型中适当地验证任何相关发现。
至关重要的是要仔细验证癌基因表达的稳定性和表型后果,并且只提交符合严格标准的测序样品。在这里,这包括用于确认敲低和挽救的蛋白质印迹,以及用于验证阳性对照的少量已知靶基因的qRT-PCR(图2)。同样重要的是,通过在每个批次中尽可能相似地仔细地进行细胞和RNA制备,尽可能减少批次变异性。
这里描述的方法在与其他类型的基因组数据配对时变得特别强大,这些数据与所研究的转录因子的全基因组功能有关。这种类型的结构功能分析的未来方向将扩展到包括ChIP-seq和ATAC-seq,以确定转录因子的结合以及染色质可及性的任何诱导变化。作为一套,这种类型的数据可以指出致癌转录因子的不同结构成分对功能的不同方面的贡献(即DNA结合与染色质修饰与共同调节剂招募)。总体而言,使用基于NGS的方法绘制融合转录因子的结构 – 功能关系可以揭示这些蛋白质致癌功能的生化决定因素的新见解。这对于进一步了解它们引起的疾病以及开发新的治疗策略非常重要。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了全国儿童医院阿比盖尔·韦克斯纳研究所的高性能计算设施的支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所[U54 CA231641至SLL,R01 CA183776至SLL]的支持;亚历克斯的柠檬水摊位基金会[ERT青年研究员奖];佩洛托尼亚[ERT奖学金];和国家卫生与医学研究委员会CJ Martin海外生物医学奖学金[APP1111032至KIP]。
Wet Lab Reagents | |||
anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
Cryotubes | For viral aliquots | ||
DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
HEPES | Gibco | 15630106 | |
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
Software | |||
Access to HPC environment | |||
AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
Cairo | 1.5-10 | ||
DESeq2 | 1.16.1 | ||
genefilter | 1.58.1 | ||
ggbiplot | 0.55 | ||
ggplot2 | 3.1.1 | ||
org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
pheatmap | 1.0.12 | ||
PuTTY | |||
R | 3.4.0 | ||
RColorBrewer | 1.1-2 | ||
reshape2 | 1.4.3 | ||
rgl | 0.100.19 | ||
R-studio | |||
STAR | Version 2.6 or later | ||
sva | 3.24.4 | ||
TrimGalore! | |||
WinSCP |