فحص عالي الإنتاجية للمركبات الكيميائية لتوضيح آثارها على الثبات البكتيري
Summary
في ورقة الطريقة هذه، نقدم استراتيجية فحص عالية الإنتاجية لتحديد المركبات الكيميائية، مثل الأوسموليت، التي لها تأثير كبير على الثبات البكتيري.
Abstract
وتعرف الثوابر البكتيرية بأنها مجموعة فرعية صغيرة من المتغيرات الظاهرية مع القدرة على تحمل تركيزات عالية من المضادات الحيوية. وهي مصدر قلق صحي مهم لأنها ارتبطت بالتهابات مزمنة متكررة. على الرغم من أن الديناميات العشوائية والحتمية للآليات المرتبطة بالإجهاد معروفة بلعب دور كبير في المثابرة ، إلا أن الآليات الكامنة وراء التحول الظاهري إلى / من حالة المثابرة ليست مفهومة تماما. وفي حين أن عوامل الثبات الناجمة عن الإشارات البيئية (مثل استنفاد الكربون والنيتروجين ومصادر الأكسجين) قد درست على نطاق واسع، فإن آثار الأوسموليت على الثبات لم تحدد بعد. باستخدام microarrays (أي 96 لوحات الآبار التي تحتوي على مواد كيميائية مختلفة)، قمنا بتصميم نهج لتوضيح آثار مختلف الأوسموليت على استمرار الإشريكية القولونية بطريقة عالية الإنتاجية. هذا النهج هو تحويلي حيث يمكن تكييفه بسهولة للصفائف الفحص الأخرى، مثل لوحات المخدرات ومكتبات خروج المغلوب الجينات.
Introduction
تحتوي الثقافات البكتيرية على عدد صغير من الخلايا الدائمة التي تتحمل مؤقتا مستويات عالية بشكل غير عادي من المضادات الحيوية. الخلايا Persister متطابقة وراثيا إلى جلودهم الحساسة للمضادات الحيوية، ويعزى بقائهم على قيد الحياة إلى تثبيط النمو العابر1. تم اكتشاف الخلايا Persister لأول مرة من قبل غلاديس هواية2 ولكن تم استخدام هذا المصطلح لأول مرة من قبل جوزيف أكبر عندما حدد لهم في الثقافات المكورات العنقودية المعالجة البنسلين3. اكتشفت دراسة أساسية نشرها بالابان وآخرون4 نوعين من الثبات: المتغيرات من النوع الأول التي تتشكل في المقام الأول عن طريق المرور عبر المرحلة الثابتة، والمتغيرات من النوع الثاني التي يتم إنشاؤها باستمرار خلال النمو الأسي. يتم الكشف عن Persisters من خلال مقايسات البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، التي تؤخذ عينات الثقافة على فترات مختلفة أثناء العلاج بالمضادات الحيوية، وغسلها، ومطلي على وسيلة نمو نموذجية لحساب الخلايا الناجية التي يمكن أن تستعمر في غياب المضادات الحيوية. يتم تقييم وجود المستمرين في ثقافة الخلية من خلال منحنى قتل ثنائي الطور4،5 حيث يشير الاضمحلال الأسي الأولي إلى وفاة الخلايا الحساسة للمضادات الحيوية. ومع ذلك ، فإن اتجاه القتل ينخفض مع مرور الوقت ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى منطقة هضبة تمثل الخلايا الثامرة الباقية على قيد الحياة.
وقد ارتبطت الخلايا persister مع أمراض مختلفة مثل السل6, التليف الكيسي7, داء المبيضات8 والتهابات المسالك البولية9. تم العثور على جميع الكائنات الحية الدقيقة تقريبا التي تم اختبارها حتى الآن لتوليد الأنماط الظاهرية المستمرة ، بما في ذلك البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض للغاية السل6، المكورات العنقودية أوريوس10، Pseudomonas aeruginosa7 وكانديدا ألبيكانز8. كما تقدم الدراسات الحديثة أدلة على صعود المسوخ المقاومة للأدوية المتعددة من الخلايا الفرعية الدائمة11،12. وقد كشفت الجهود الكبيرة المبذولة في هذا المجال أن آليات الثبات معقدة ومتنوعة للغاية؛ وأن الآليات التي لا يمكن أن تكون أكثر تعقيدا من أي بلد آخر، لا سيما في مجال مكافحة الهجمات، لا سيما في مجال الآليات التي لا يمكن أن تكون لها أهمية في مجال الجهود كل من العوامل العشوائية والحتمية المرتبطة استجابة SOS13،14، أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)15، أنظمة السموم / مضادات السموم (TA)16، autophagy أو الهضم الذاتي17 والاستجابة الصارمة ذات الصلة ppGpp18 معروفة لتسهيل تشكيل أكثر استمرارا.
على الرغم من التقدم الكبير في فهم النمط الظاهري المثابرة ، لم يتم فهم آثار الأوسموليت على الثبات البكتيري بشكل كامل. وبما أن الحفاظ على الضغط التناضحي الأمثل هو ضرورة لنمو الخلايا وحسن سير عملها وبقائها على قيد الحياة، فإن إجراء دراسة متعمقة للنحلات يمكن أن يؤدي إلى أهداف محتملة للاستراتيجيات المضادة للاستمرار. على الرغم من شاقة, فحص عالية الإنتاجية هو نهج فعال جدا لتحديد الأيض والمواد الكيميائية الأخرى التي تلعب دورا حاسما في النمط الظاهري استمرار19,20. في هذا العمل، سنناقش طريقتنا المنشورة19،حيث استخدمنا microarrays، أي 96 لوحة بئر تحتوي على أوزموليتات مختلفة (على سبيل المثال، كلوريد الصوديوم، اليوريا، نيتريت الصوديوم، نترات الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم)، لتحديد الأوسموليت التي تؤثر بشكل كبير على استمرار الإشريكية القولونية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير المقايسة المستمرة عالية الإنتاجية الموصوفة هنا لتوضيح آثار المواد الكيميائية المختلفة على استمرار الإشريكية القولونية. بالإضافة إلى لوحات PM التجارية، يمكن إنشاء microarrays يدويا كما هو موضح في الخطوة 4.2. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول المعروض هنا مرن ويمكن استخدامه لفحص الميكر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مختبر أورمان على مساهماتهم القيمة خلال هذه الدراسة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة / NIAID K22AI125468 جائزة الانتقال الوظيفي ومنحة بدء التشغيل في جامعة هيوستن.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
