Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını
Summary
Bu yöntem makalesinde, bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkisi olan ozmolitler gibi kimyasal bileşikleri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama stratejisi sunuyoruz.
Abstract
Bakteriyel kalıcılar, yüksek konsantrasyonlarda antibiyotikleri tolere etme yeteneğine sahip fenotipik varyantların küçük bir altopülasyonu olarak tanımlanır. Tekrarlayan kronik enfeksiyonlarla ilişkili oldukları için önemli bir sağlık sorunudur. Strese bağlı mekanizmaların stokastik ve deterministik dinamiklerinin kalıcılıkta önemli rol oynadığı bilinse de, kalıcılık durumuna/kalıcılıktan fenotipik geçişin altında kalan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Çevresel sinyallerin tetiklediği kalıcılık faktörleri (örneğin karbon, azot ve oksijen kaynaklarının tükenmesi) kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, ozmolitlerin kalıcılık üzerindeki etkileri henüz belirlenmemiştir. Mikroarraylar (yani, çeşitli kimyasallar içeren 96 kuyu plakası) kullanarak, çeşitli ozmolitlerin Escherichia coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini yüksek verimde aydınlatacak bir yaklaşım tasarladık. Bu yaklaşım, ilaç panelleri ve gen nakavt kütüphaneleri gibi diğer tarama dizileri için kolayca uyarlanabilebileceği için dönüştürücüdür.
Introduction
Bakteri kültürleri, alışılmadık derecede yüksek antibiyotik seviyelerine geçici olarak hoşgörülü olan kalıcı hücrelerin küçük bir alt nüfusunu içerir. Persister hücreleri genetik olarak antibiyotiğe duyarlı kins ile aynıdır ve hayatta kalmaları geçici büyüme inhibisyonlarına bağlanmıştır1. Persister hücreleri ilk olarak Gladys Hobby2 tarafından keşfedildi, ancak bu terim ilk olarak Joseph Bigger tarafından penisilinle tedavi edilen Staphylococcus pyogenes kültürlerinde tanımlandığında kullanıldı3. Balaban ve ark.4 tarafından yayınlanan ufuk açıcı bir çalışma iki kalıcı tip keşfetti: öncelikle sabit fazdan geçişle oluşturulan tip I varyantları ve üstel büyüme sırasında sürekli olarak oluşturulan tip II varyantları. Kalıcılar, antibiyotik tedavileri sırasında çeşitli aralıklarla kültür örneklerinin alındığı, yıkandığı ve antibiyotik yokluğunda kolonileşebilen hayatta kalan hücreleri saymak için tipik bir büyüme ortamına kaplandığı klonojenik sağkalım tahlilleri ile tespit edilir. Bir hücre kültüründe kalıcıların varlığı, ilk üstel çürümenin antibiyotiğe duyarlı hücrelerin ölümünü gösterdiği bifazik öldürme eğrisi4,5 ile değerlendirilir. Bununla birlikte, öldürme eğilimi zamanla azalır ve sonunda hayatta kalan kalıcı hücreleri temsil eden bir plato bölgesine yol açmaktadır.
Kalıcı hücreler tüberküloz6, kistik fibrozis7,kandidiyazis8 ve idrar yolu enfeksiyonları9gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Şimdiye kadar test edilen hemen hemen tüm mikroorganizmaların, son derece patojenik Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 ve Candida albicans8dahil olmak üzere kalıcı fenotipler ürettiği bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca kalıcı subpopulasyonlardan multidrug dirençli mutantların yükselişinin kanıtlarını salar11,12. Bu alandaki önemli çabalar, kalıcılık mekanizmalarının son derece karmaşık ve çeşitli olduğunu ortaya koydu; SOS yanıtı13 , 14, reaktif oksijen türleri (ROS)15,toksin/antitoksin (TA) sistemleri16,otofaji veya kendi kendine sindirim17ve ppGpp ile ilgili sıkı yanıt18 ile ilişkili stokastik ve deterministik faktörlerin kalıcı oluşumu kolaylaştırdığı bilinmektedir.
Kalıcılık fenotipini anlamada önemli ilerlemeye rağmen, ozmolitlerin bakteriyel kalıcılık üzerindeki etkileri tam olarak anlaşılamamıştır. Optimal ozmotik basıncın sürdürülmesi hücrelerin büyümesi, düzgün çalışması ve hayatta kalması için bir gereklilik olduğundan, ozmolitlerin derinlemesine incelenmesi anti-persister stratejiler için potansiyel hedeflere yol açabilir. Zahmetli, yüksek verimli tarama, kalıcılık fenotipinde çok önemli bir rol oynayan metabolitleri ve diğer kimyasalları tanımlamak için çok etkili bir yaklaşım olmasına rağmen19,20. Bu çalışmada, E. coli persistence’ı önemli ölçüde etkileyen ozmolitleri tanımlamak için çeşitli ozmolitler (örneğin sodyum klorür, üre, sodyum nitrit, sodyum nitrat, potasyum klorür) içeren 96 kuyu plakası gibi mikroarraylar kullandığımız yayınlanmış yöntem19’utartışacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yüksek verim kalıcı tahlili, çeşitli kimyasalların E. coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir. Ticari PM plakalarına ek olarak, mikroarraylar adım 4.2’de açıklandığı gibi manuel olarak inşa edilebilir. Ayrıca, burada sunulan protokol esnektir ve 96 kuyu plakası formatında olan ilaç panelleri ve hücre kütüphaneleri gibi diğer mikroarrayları taramak için kullanılabilir. Büyüme evresi, aşılama oranı ve ortam dahil olmak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Orman Lab üyelerine bu çalışma sırasındaki değerli girdileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIAID K22AI125468 kariyer geçiş ödülü ve Houston Üniversitesi başlangıç hibesi tarafından finanse edildi.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
- Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
- Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
- Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
- Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
- Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
- Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
- Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
- Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
- Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
- Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
- Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
- Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
- Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
- Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
- Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
- Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
- Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).
