多機能Ser/ThrキナーゼAURKAの活性化は、Thr288の自己リン酸化によって特徴付けられます。ここでは、プローブエンジニアリングの戦略と、有糸分裂全体のキナーゼ活性化に従う迅速なFRETプロトコルを示す。
上皮癌は、しばしばSer/ThrキナーゼオーロラA /AURKAの過剰発現によって特徴付けられます。AURKAはThr288での自己リン酸化時に活性化する多機能タンパク質であり、有糸分裂におけるAURKAの豊富なピークは、有糸性紡錘の安定性と忠実度、および有糸分裂の全体的な効率を制御する。構造レベルで十分に特徴付けられるが、細胞周期を通してAURKAの活性化の一貫したモニタリングが欠けている。可能な解決策は、遺伝的にコード化されたフェルスターの共鳴エネルギー伝達(FRET)バイオセンサーを使用して、十分な時間的解像度でAURKAの自己リン酸化に関する洞察を得ることから成り立っています。ここでは、Thr288自動リン酸化を検出するFRETバイオセンサーを設計するプロトコルと、この変化を有糸分裂中にどう従うかについて説明する。まず、ドナー/アクセプターFRETペアの概要を説明し、哺乳動物細胞におけるAURKA FRETバイオセンサーのクローニングおよび挿入方法について説明します。次に、カスタム構築されたセットアップで蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)による迅速なFRET測定のステップバイステップ分析を行います。ただし、このプロトコルは、代替の商用ソリューションにも適用できます。我々は、AURKAベースのバイオセンサーに最も適切なFRET制御を検討し、このツールの感度をさらに高めるための潜在的な将来の改善を強調することによって結論付ける。
オーロラキナーゼA/AURKAは多機能なセリン/スレオニンキナーゼであり、細胞周期を通して、そして異なる細胞内の区画1で活性である。AURKAはしばしば上皮性および造影性悪性腫瘍で過剰発現し、患者は現在利用可能な治療法に対する反応性が低いため、その広範な時空間的活性化を理解することは癌において特に重要である2。
構造研究は、AURKAが非アクティブからアクティブキナーゼに変換するために2つのステップを受けることを明らかにしました。まず、Thr288の自己リン酸化はキナーゼの運動用ポケットの立体構造を変化させ、それを活性化させる3,4,5,6。このステップは、ヒト細胞およびゼノプスlaevis3,6,7におけるAURKAの触媒活性を増加させ、キナーゼを完全な活性のためにプライミングする。一度活性化されると、AURKAとXklp2(TPX2)の標的タンパク質との相互作用は、第2の立体構造変化を誘導する5。このさらなる変更により、AURKAはセル5,8,9,10の基質に向かって完全な酵素活性に達することができます。
約20年間、AURKAの活性化と活性に関する洞察は、主に生化学的アプローチの組み合わせを通じて得られました。これらには、AURKA活性化の特徴として細胞または生体内でリン酸化Thr288の検出、結晶学的分析、およびAURKA1の活性をプローブするインビトロまたはセルロキナーゼアッセイが含まれる。しかし、これらのアプローチの時空間的な解決は貧弱または存在せず、これら2つの事象のダイナミクスの知識を広げるためには新しい解決策が必要であった。
ここ数年の蛍光プローブの開発は、生細胞におけるAURKAのモニタリングを促進し、より大きな時空間分解能で以下の活性化を可能にした。これまでに開発されたAURKAの最も特異的なセンサは、FRET原理(Försterの共振エネルギー伝達)11に依存して、非アクティブなAURKAとアクティブなAURKAを区別しています。最初に開発されたセンサは、AURKAキナーゼ活性の基質ベースのバイオセンサーであった。基質ベースのバイオセンサーは、リン酸化のために与えられたキナーゼによって標的となる短いアミノ酸配列によって構成され、ドナー/アクセプタFRETペアおよびリン酸化残基を認識する結合ドメイン内に挿入され、効率的なFRETプロセス12のためのバイオセンサーの折り畳みを助ける。AURKAの場合、リン酸化によって標的となるKIF2Cの14アミノ酸フラグメントをCFP-YFPドナー/アクセプタpair13の間に挿入した。しかし、このセンサには大きな欠点があります。まず、このプローブに使用されるKIF2C配列をAURKAと密接に関連するキナーゼAURKBの両方で標的化することができ、これによりこのバイオセンサの特異性を低下させることができる。第二に、センサーは、リン酸化のために内因性キナーゼに依存しています。したがって、FRETの効率は、キナーゼの量が制限されている場合(例えば、細胞内区画または細胞周期段階で)検出できないか、または有意ではない。これらの制限を克服するために、新しいクラスのAURKAセンサーが「立体構造センサー」と呼ばれる新しいクラスを作られました。これらのプローブでは、AURKAの全長配列をN末流のドナー蛍光素内に挿入し、C末語でアクセプターフルオロフォアを挿入した。非アクティブなAURKAは、キナーゼのN-およびC末語を互いに遠ざける「オープン」な立体構造を提示する。2つの末語間(>10 nm)間の距離を持つドナー/アクソクサのペアは、FRETの非許容構成になります。それどころか、自己リン酸化AURKAは、2つのタンパク質末語と2つのフルオロフォアが近接して「閉じた」立体構造を採用しています。これは、ドナーとアクセクサとの間のFRETを可能にすることが示された、ドナー寿命14,15の変動を用いて測定することができる。このようなプローブはいくつかの利点を提示する。まず、それらは遺伝的にコードされ、細胞内の内因性キナーゼを置き換えるために使用することができる。第二に、AURKAのノックダウンによって誘発された表型を救出し、細胞内で機能していることを示す。第三に、それらは異なる細胞内区画および細胞周期を通してキナーゼの活性化に従うことを可能にする。このプローブは、キナーゼが活性化することが知られている場所(すなわちセントロソームおよび有糸性紡錘)でAURKAの活性化を検出し、またミトコンドリア16でAURKAの活性化を発見することに関与した。最後に、これらのセンサはFRET/FLIMに基づく高含有スクリーニングを可能にし、そこでAURKAの立体構造変化を使用して新しい薬理学的阻害剤を同定した17。
本研究では、培養細胞におけるAURKA活性化を可視化する手順について説明する。まず、FRETの蛍光ポアペアの可能性について洞察を行います。最も適したドナー/アクソクサペアの選択は、利用可能な顕微鏡のセットアップ、または多重FRET18,19として特定の下流アプリケーションに従って行われます。次に、迅速なFRET/FLIM顕微鏡セットアップで選択したバイオセンサの挙動を探るパイプラインを提案する。このパイプラインは、細胞培養および同期手順から FLIM 取得およびデータ分析まで拡張されます。最後に、バイオセンサ設計の類似戦略を他のキナーゼに適用し、他のFRETベースのイメージングシステムでも使用することができるので、このプロトコルの潜在的な利点について議論します。
遺伝子組み換えFRETバイオセンサーは、単一タンパク質またはシグナル伝達経路全体の活性化を測定するための信頼性の高いツールである41。特に、AURKA FRETバイオセンサーは、時間と空間におけるキナーゼの活性化を探索する優先的な方法を構成する。しかし、FRETバイオセンサーを設計または最適化する際には、一般的な用語だけでなく、AURKAに対して特に注意を払う必要がある要素もあります。
第一に、ドナー/アクセプターFRETペアの性質と相対位置を、このキナーゼの特定の機能に適合させることができる。AURKAは有糸分裂の間に有糸球体で非常に富化されるが、それは細胞周期全体および異なった細胞の位置(例えば、セントロソーム、核およびミトコンドリア)1,2に存在する。バイオセンサーが、酸性pHに到達できるミトコンドリアのような特定のコンパートメントで使用される場合、mTurquoise2/shadowGとしてpH感受性ドナーアクセプターFRETペアを選択する必要があります。さらに、FRETドナーをC末に置くことで、この細胞下コンパートメントでバイオセンサーをよりよく視覚化することができ、AURKA N末語がミトコンドリア16,42で部分的に切断することが示されたことを考えると、FRET検出を最適化する可能性さえある。
第二に、AURKA FRETバイオセンサーを最適化する未踏の方法は、フルレングスAURKAとドナー/アクセクサペアの間のリンカーのより慎重な設計を必要とするであろう。蛍光対間の距離だけでなく、リンカー自体の特性もFRET効率を向上させる重要な要因であることが示された43,44,45,46。この光の中で、リンカーの剛性または柔軟性を高めることは、FRET効率に有害であるか、またはさらに改善することができる。
第3に、AURKAの過剰発現が有数の細胞2の割合で有糸分裂性紡錘異常を誘導することが知られている。哺乳動物発現ベクターに見られる最も一般的なプロモーターの1つであるサイトメガロウイルス(CMV)のような強力なプロモーターの下で、またはAURKA最小プロモーター配列(CTTCCGG)14,47の下で同じFRET構築物を発現することによって得られたΔLifetimeを比較することは興味深いだろう。このプロモーターは、キナーゼのノックダウン後に生じる単極性または多極スピンドルを救出することが以前に示され、その使用はse14,47当たりの細胞周期摂動を誘発しなかった。FLIMはcell11のタンパク質発現レベルおよび相対濃度に対して無神経であるが、同じバイオセンサーのセットアップで2つのプロモーターを完全に比較することによって利益を得ることは、任意の場所で活性化されたAURKAのプールの理解を広げるだろう。さらに、上皮癌および血液学的癌のパラダイムに関連する過剰発現時にAURKA活性化がどのように変化するかについての新しい洞察を提供するであろう。
最後に、ダウンストリームの FRET アプリケーションも考慮する必要があります。AURKAの分野における将来の展望は、基質ベースのバイオセンサーを用いてキナーゼ立体構造バイオセンサーを累積することである。2つのバイオセンサーのFRET挙動を同時に分析する(マルチプレックスFRETと呼ばれるプロセス)は、第2のドナーチャネルでスペクトルブリードを避けるために、第1のバイオセンサーに暗いアクセクターを必要とします。AURKAの文脈では、これは第1のバイオセンサーでキナーゼの活性化を検出するエキサイティングな新しい視点を開き、第2のバイオセンサーと与えられた基板に向かってその酵素活性を開くだろう。マルチプレキシングの最近の開発により、同時に最大3つのバイオセンサーを一度に累積できるようになりました48.AURKAの文脈で同様の方法を適用することは、キナーゼの活性化活動相互作用をテストするだけでなく、前例のない時空間的解像度でAURKAシグナル伝達カスケードを探索する非常に有望な戦略を表す可能性があります。
結論として、FRET/FLIMはタンパク質活性に関する知識を深める便利な方法です。一方で、少なくとも1つの蛍光部分のおかげで、生細胞内の特定のタンパク質の局在を可視化することができます。一方、タンパク質の立体構造の変化を解明することができ、タンパク質の活性化や活性に有益である可能性があります。したがって、FRET/FLIMおよび立体構造FRETバイオセンサーは、生細胞のシグナル伝達経路に従う広範な方法になり、絶妙な時空間分解能を有する可能性を秘めている。
The authors have nothing to disclose.
顕微鏡レンヌイメージングセンター(MRic、BIOSIT、レンヌ、フランス)のエンジニアに、アドバイスと助け、特にX.ピンソンの原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。MRicは、フランス国家研究庁(ANR-10-INBS-04)が支援する国家インフラフランスバイオイメージングのメンバーです。この作品は、 センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック (CNRS)、 リーグ・コントル・ル・ガン・コミテ・ディレ・エ・ヴィレーヌ、デ・コート・ダルモール・エ・デュ・フィニステール、協会が ラ・レシェルシュ・コントル・ル・ガン(ARC)を G.Bに注ぎます。
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |