Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction
Summary
Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.
Abstract
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.
Introduction
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas1. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas2. Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modificação do método de incubação que supera essa limitação sem sacrificar a sensibilidade.
Durante a incubação da membrana, os anticorpos flutuam em solução enquanto os antígenos são imobilizados na membrana. Devido à sua alta afinidade, a taxa de ligação de anticorpos ao antígeno é mais rápida do que a difusão de anticorpos da solução a granel para a membrana. Isso cria uma baixa concentração “camada de esgotamento”(Figura 1). Pode levar horas para anticorpos mais distantes chegarem à membrana por meio da difusão passiva, que é o principal fator responsável por longos tempos de incubação nesta técnica. Esse efeito é chamado de limitação de transporte de massa (MTL)3. Foi proposto que a drenagem repetitiva e a reposição da solução contendo anticorpos podem interromper a camada de esgotamento e superar o MTL4. Aqui, elaboramos uma técnica única que implementa este conceito de drenagem e reposição cíclica (CDR) para diminuir o efeito do MTL em um protocolo tradicional de manchas ocidentais e comentou encurtar o período de incubação necessário.
Para manter a sensibilidade de detecção com um curto tempo de incubação, fizemos uso de uma tecnologia de aprimoramento da imunoreaction que acelera a reação de anticorpos de antígeno, melhorando assim a relação sinal-ruído5. Muitos agentes de imunoreação disponíveis comercialmente (IRE) consistem em 2 componentes (Solução 1 e 2, ver Tabela de Materiais). A composição proprietária ou mecanismo de ação do IRE não foi divulgada, mas descobrimos anteriormente que o IRE diminuiu a constante de dissociação entre o antígeno e o anticorpo em ensaios de ligação de fase sólida, indicando que o aumento da afinidade é, pelo menos em parte, responsável pelo efeito de aumento do IRE6. A combinação de CDR com IRE produz um protocolo de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade que reduz todo o tempo de procedimento sem sacrificar a sensibilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica2,9,10,11,12<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramuros, Instituto Nacional de Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde. A S.H. foi apoiada pelo Programa de Estudos de Estudantes de Parceria Público-Privada do Japão no Exterior, e H.N. e K.Y. foram pela Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
