使用免疫增强技术的超高速西布洛特
Summary
通过循环排泄和补充 （CDR） 技术与免疫增异剂一起改进抗原抗体结合的动能，开发出一种超高速西方印迹技术。
Abstract
西方的污点（也称为免疫虫）是生物医学研究的规范方法。它通常用于确定特定蛋白质的相对大小和丰度以及转化后蛋白质的修饰。这种技术具有丰富的历史，由于其简单性，仍然被广泛使用。然而，西方的印迹程序著名的需要几个小时，甚至几天，完成，一个关键的瓶颈是长期的潜伏时间，限制其吞吐量。由于抗体从散装溶液缓慢扩散到膜上的固定抗原，因此需要这些培养步骤：膜附近的抗体浓度远远低于散装浓度。在这里，我们提出了一项创新，通过循环排空和补充抗体溶液 （CDR） 来改善抗原结合，从而显著缩短这些潜伏间隔。我们还利用了增强免疫力的技术来保持检测的灵敏度。CDR方法与商业免疫增强剂相结合，提高了输出信号，大大缩短了抗体潜伏时间。由此产生的超高速西部污点可以在20分钟内完成，而不会失去任何灵敏度。该方法可同时使用化学发光和荧光检测方法应用于西方污点。这种简单的协议使研究人员能够更好地探索许多样本中蛋白质表达的分析。
Introduction
西方的污点（也称为免疫虫）是一种强大而基本的技术，跨越广泛的科学和临床学科。该技术用于检查蛋白质1的存在、相对丰度、相对分子质量和转化后修饰。结合数字图像分析，该方法可以可靠地分析蛋白质的丰度和蛋白质的修饰2。虽然西方的污点是例行公事，但它是一种耗时和劳动密集型的方法。需要用膜长期培养抗体。在这里，我们描述了对孵化方法的修改，该方法克服了这一限制，而不会牺牲灵敏度。
在膜的孵化过程中，抗体漂浮在溶液中，而抗原则固定在膜上。由于其亲和力高，抗体与抗原结合的速度比抗体从散装溶液扩散到膜的速度要快。这会产生低浓度的”消耗层”（图 1）。较远的抗体可能需要数小时才能通过被动扩散到达膜，而被动扩散是导致该技术长期潜伏的主要因素。此效果称为大众运输限制 （MTL）3。有人提出，重复排空和补充含抗体溶液可能会破坏耗竭层，克服MTL4。在这里，我们设计了一种独特的技术，实现这种循环排水和补充 （CDR） 概念，以减少 MTL 在传统的西方印迹协议中的影响，并显著缩短所需的潜伏期。
为了在短的潜伏时间内保持检测灵敏度，我们采用了提高免疫力增强技术，加速抗原抗体反应，从而提高了信号噪声比5。许多市售的免疫增强剂 （IRE） 由 2 个组件组成（解决方案 1 和 2，见 材料表）。IRE的专有成分或作用机制尚未披露，但我们先前发现，IRE在固体相绑定检测中减少了抗原和抗体之间的分离常数，表明亲和力的增强至少部分地对IRE6的增强作用负有责任。CDR 与 IRE 的结合产生了一种超高速的西方印迹处理方案，可在不牺牲灵敏度的情况下缩短整个过程时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
西方污点是一种广泛使用的分析技术，用于检测40年前7、8年前开发的特定蛋白质。此后，该技术不断发展，随后的创新提高了技术2、9、10、11、12、13的灵敏度、速度和定量。此处介绍的增强型超高速西?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院内脏研究司、国家心脏、肺和血液研究所的支持。S.H.得到日本公私合作学生出国留学计划的支持，H.N.和K.Y.获得Valor和V药物海外培训奖学金。
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
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