Ultra-High-Speed Western Blot ved hjælp af immunoreaktionsfremmende teknologi
Summary
En ultra-high-speed vestlige blotting teknik er udviklet ved at forbedre kinetik af antigen-antistof bindende gennem cyklisk dræning og genopfyldning (CDR) teknologi i forbindelse med en immunoreaktion styrke agent.
Abstract
En vestlig skamplet (også kendt som en immunoblot) er en kanonisk metode til biomedicinsk forskning. Det er almindeligt anvendt til at bestemme den relative størrelse og overflod af specifikke proteiner samt post-translationelle protein modifikationer. Denne teknik har en rig historie og forbliver i udbredt brug på grund af sin enkelhed. Men den vestlige blotting procedure berømt tager timer, selv dage, at fuldføre, med en kritisk flaskehals er den lange inkubation gange, der begrænser dens gennemløb. Disse inkubationstrin er påkrævet på grund af den langsomme diffusion af antistoffer fra bulkopløsningen til de immobiliserede antigener på membranen: antistofkoncentrationen nær membranen er meget lavere end bulkkoncentrationen. Her præsenterer vi en innovation, der dramatisk reducerer disse inkubationsintervaller ved at forbedre antigenbinding via cyklisk dræning og genopfyldning (CDR) af antistofopløsningen. Vi har også brugt en immunoreaktion styrke teknologi til at bevare følsomheden af analysen. En kombination af CDR-metoden med et kommercielt immunoreaktionsforbedrende middel øgede udgangssignalet og reducerede antistofinkubationstiden betydeligt. Den resulterende ultra-high-speed vestlige skamplet kan opnås på 20 minutter uden tab i følsomhed. Denne metode kan anvendes på vestlige blots ved hjælp af både chemiluminescent og fluorescerende detektion. Denne enkle protokol giver forskere mulighed for bedre at udforske analysen af proteinudtryk i mange prøver.
Introduction
En vestlig skamplet (også kendt som en immunoblot) er en kraftfuld og grundlæggende teknik på tværs af en bred vifte af videnskabelige og kliniske discipliner. Denne teknik bruges til at undersøge tilstedeværelsen, relativ overflod, relativ molekylmasse og postoversættelsesændringer af proteiner1. Kombineret med digital billedanalyse kan denne metode pålideligt analysere overfloden af proteiner og proteinmodifikationer2. Selvom vestlig skamplet udføres rutinemæssigt, er det en tidskrævende og arbejdskrævende metode. Lange inkubationer af antistoffet med membraner er påkrævet. Her beskriver vi en ændring af inkubationsmetoden, der overvinder denne begrænsning uden at ofre følsomhed.
Under inkubation af membranen flyder antistoffer i opløsning, mens antigener immobiliseres på membranen. På grund af deres høje affinitet er antistofbindingshastigheden for antigenet hurtigere end diffusionen af antistoffer fra bulkopløsningen til membranen. Dette skaber en lav koncentration “udtømning lag” (Figur 1). Det kan tage timer for fjernere antistoffer at nå membranen via passiv diffusion, som er den vigtigste faktor, der er ansvarlig for lange inkubationstider i denne teknik. Denne effekt kaldes massetransportbegrænsningen (MTL)3. Det er blevet foreslået, at gentagen dræning og genopfyldning af den antistofholdige opløsning kan forstyrre udtømningslaget og overvinde MTL4. Her har vi udtænkt en unik teknik, der implementerer dette cykliske drænings- og genopfyldningskoncept (CDR) for at mindske effekten af MTL i en traditionel vestlig blotting-protokol og markant forkorte den krævede inkubationsperiode.
For at opretholde detektionsfølsomheden med en kort inkubationstid gjorde vi brug af en immunoreaktionsfremmende teknologi, der fremskynder antigen-antistofreaktionen og derved forbedrede signal-til-støj-forholdet5. Mange kommercielt tilgængelige immunoreaktionsfremmende midler (IRE) består af 2 komponenter (løsning 1 og 2, se materialetabel). IRE’s proprietære sammensætning eller virkningsmekanisme er ikke blevet afsløret, men vi har tidligere konstateret, at IRE reducerede dissociationskonstanten mellem antigenet og antistoffet i faste fasebindingsanalyser, hvilket indikerer øget affinitet er i det mindste delvis ansvarlig for den forstærkende virkning af IRE6. Kombinationen af CDR med IRE giver en ultra-high-speed vestlige blotting protokol, der reducerer hele proceduren tid uden at ofre følsomhed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western blot er en udbredt analytisk teknik til at opdage specifikke proteiner, der blev udviklet ~ 40 år siden7,8. Siden da har teknikken fortsat med at udvikle sig, med efterfølgende innovationer, der forbedrer følsomheden, hastigheden og kvantantitationen af teknikken2,9,10,11,12,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Division of Intramural Research, National Heart, Lung, og Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. blev støttet af Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, og H.N. og K.Y. var af Valor og V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
