इम्यूनोरेक्शन बढ़ाने वाली तकनीक का उपयोग करके अल्ट्रा-हाई-स्पीड वेस्टर्न ब्लॉट
Summary
एक अल्ट्रा-हाई-स्पीड वेस्टर्न ब्लॉटिंग तकनीक को इम्यूनोरेक्शन बढ़ाने वाले एजेंट के साथ मिलकर साइक्लिक ड्रेनिंग एंड रिभराई (सीडीआर) तकनीक के माध्यम से एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग के काइनेटिक्स में सुधार करके विकसित किया गया है।
Abstract
एक पश्चिमी धब्बा (जिसे इम्यूनोब्लॉट भी कहा जाता है) बायोमेडिकल शोध के लिए एक विहित विधि है। यह आमतौर पर सापेक्ष आकार और विशिष्ट प्रोटीन की बहुतायत के साथ ही बाद अनुवाद प्रोटीन संशोधनों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक का एक समृद्ध इतिहास है और इसकी सादगी के कारण व्यापक उपयोग में रहता है। हालांकि, पश्चिमी दाग प्रक्रिया मशहूर घंटे लगते हैं, यहां तक कि दिन, पूरा करने के लिए, एक महत्वपूर्ण अड़चन के साथ लंबे समय इनक्यूबेशन बार है कि अपने थ्रूपुट सीमा जा रहा है । झिल्ली पर स्थिर एंटीजन के थोक समाधान से एंटीबॉडी के धीमे प्रसार के कारण इन इनक्यूबेशन चरणों की आवश्यकता होती है: झिल्ली के पास एंटीबॉडी एकाग्रता थोक एकाग्रता की तुलना में बहुत कम होती है। यहां, हम एक नवाचार पेश करते हैं जो एंटीबॉडी समाधान के चक्रीय निकासी और भरपाई (सीडीआर) के माध्यम से एंटीजन बाध्यकारी में सुधार करके इन इनक्यूबेशन अंतरालों को नाटकीय रूप से कम करता है। हमने परख की संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए एक इम्यूनोरिएक्शन बढ़ाने वाली तकनीक का भी उपयोग किया। एक वाणिज्यिक इम्यूनोरिएक्शन बढ़ाने वाले एजेंट के साथ सीडीआर विधि के संयोजन ने आउटपुट सिग्नल को बढ़ाया और इनक्यूबेशन समय एंटीबॉडी को काफी कम कर दिया। जिसके परिणामस्वरूप अल्ट्रा उच्च गति पश्चिमी दाग संवेदनशीलता में किसी भी नुकसान के बिना 20 मिनट में पूरा किया जा सकता है । इस विधि को केमिल्यूमिनेसेंट और फ्लोरोसेंट डिटेक्शन दोनों का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉट्स पर लागू किया जा सकता है। यह सरल प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कई नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण का बेहतर पता लगाने की अनुमति देता है।
Introduction
एक पश्चिमी धब्बा (जिसे इम्यूनोब्लॉट के रूप में भी जाना जाता है) वैज्ञानिक और नैदानिक विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक शक्तिशाली और मौलिक तकनीक है। इस तकनीक का उपयोग प्रोटीन 1 की उपस्थिति, सापेक्ष बहुतायत, सापेक्ष आणविक द्रव्यमान और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की जांच करने के लिए कियाजाताहै। डिजिटल छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त, यह विधि मज़बूती से प्रोटीन और प्रोटीन संशोधनों की बहुतायत का विश्लेषण कर सकती है2। हालांकि पश्चिमी दाग नियमित रूप से किया जाता है, यह एक समय लेने वाली और श्रम गहन विधि है । झिल्ली के साथ एंटीबॉडी के लंबे ऊष्मायनों की आवश्यकता होती है। यहां, हम इनक्यूबेशन विधि के एक संशोधन का वर्णन करते हैं जो संवेदनशीलता का त्याग किए बिना इस सीमा पर काबू पा लेता है।
झिल्ली के इनक्यूबेशन के दौरान, एंटीबॉडी समाधान में तैरते हैं जबकि एंटीजन झिल्ली पर स्थिर होते हैं। उनकी उच्च आत्मीयता के कारण, एंटीजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी की दर झिल्ली के थोक समाधान से एंटीबॉडी के प्रसार की तुलना में तेज है। यह एक कम एकाग्रता “कमी परत”(चित्र 1) बनाता है। निष्क्रिय प्रसार के माध्यम से झिल्ली तक पहुंचने में अधिक दूर एंटीबॉडी के लिए घंटों लग सकते हैं, जो इस तकनीक में लंबे इनक्यूबेशन समय के लिए जिम्मेदार मुख्य कारक है। इस प्रभाव को मास ट्रांसपोर्ट लिमिटेशन(एमटीएल) 3कहा जाता है। यह प्रस्ताव किया गया है कि एंटीबॉडी युक्त समाधान को दोहराने और भरने से कमी की परत बाधित हो सकती है औरएमटीएल 4पर काबू पा लिया जा सकता है । यहां, हमने एक अनूठी तकनीक तैयार की है जो पारंपरिक पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल में एमटीएल के प्रभाव को कम करने के लिए इस चक्रीय निकासी और भरपाई (सीडीआर) अवधारणा को लागू करती है और आवश्यक इनक्यूबेशन अवधि को कम करती है।
थोड़े से इनक्यूबेशन समय के साथ पता लगाने की संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए, हमने एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को तेज करने वाली इम्यूनोरिएक्शन बढ़ाने वाली तकनीक का उपयोग किया, जिससे सिग्नल-टू-शोर अनुपात 5 में सुधारहुआ। कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इम्यूनोरिएक्शन बढ़ाने वाले एजेंट (आईआरई) में 2 घटक होते हैं (समाधान 1 और 2, सामग्री की तालिकादेखें)। मालिकाना संरचना या IRE की कार्रवाई के तंत्र का खुलासा नहीं किया गया है, लेकिन हम पहले पाया है कि IRE ठोस चरण बाध्यकारी परख में एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच लगातार वियोजन में कमी आई है, बढ़ी हुई आत्मीयता का संकेत है, कम से कम भाग में, IRE6के प्रभाव को बढ़ाने के लिए जिंमेदार है । आईआरई के साथ सीडीआर का संयोजन एक अल्ट्रा-हाई-स्पीड वेस्टर्न ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल की पैदावार करता है जो संवेदनशीलता का त्याग किए बिना पूरी प्रक्रिया के समय को कम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पश्चिमी दाग विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विश्लेषणात्मक तकनीक है जिसे ~ 40 साल पहले विकसित किया गया था7,8. तब से, तकनीक लगातार विकसित होती जा र…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इंट्राम्यूरल रिसर्च, नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के डिवीजन द्वारा समर्थित किया गया था। एसएच जापान सार्वजनिक-निजी भागीदारी छात्र अध्ययन विदेश कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, और एचएन और केवाई वीरता और वी ड्रग ओवरसीज प्रशिक्षण छात्रवृत्ति द्वारा थे ।
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
