Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik
Summary
En ultrahög hastighet western blotting teknik utvecklas genom att förbättra kinetiken av antigen-antikropp bindning genom cyklisk dränering och påfyllning (CDR) teknik i samband med en immunoreaction förbättra agent.
Abstract
En västerländsk fläck (även känd som en immunoblot) är en kanonisk metod för biomedicinsk forskning. Det används ofta för att bestämma den relativa storleken och överflöd av specifika proteiner samt post-translationella proteinmodifieringar. Denna teknik har en rik historia och är fortfarande i utbredd användning på grund av dess enkelhet. Men det västerländska blotting-förfarandet tar berömt timmar, till och med dagar, att slutföra, med en kritisk flaskhals som är de långa inkubationstiderna som begränsar dess genomströmning. Dessa inkubationssteg krävs på grund av långsam diffusion av antikroppar från bulklösningen till de immobiliserade antigenerna på membranet: antikroppskoncentrationen nära membranet är mycket lägre än bulkkoncentrationen. Här presenterar vi en innovation som dramatiskt minskar dessa inkubationsintervaller genom att förbättra antigenbindningen via cyklisk tömning och påfyllning (CDR) av antikroppslösningen. Vi använde också en immunoreaction förbättra teknik för att bevara känsligheten hos analysen. En kombination av CDR-metoden med ett kommersiellt immunoreaction förbättra agent ökade utgångssignalen och avsevärt minskade antikropp inkubationstiden. Den resulterande ultrahöga västra fläcken kan åstadkommas på 20 minuter utan någon förlust i känslighet. Denna metod kan tillämpas på västerländska blots med både chemiluminescent och fluorescerande detektion. Detta enkla protokoll gör det möjligt för forskare att bättre utforska analysen av proteinuttryck i många prover.
Introduction
En western blot (även känd som en immunoblot) är en kraftfull och grundläggande teknik inom ett brett spektrum av vetenskapliga och kliniska discipliner. Denna teknik används för att undersöka förekomsten, relativa överflöd, relativ molekylär massa och post-translationella modifieringar av proteiner1. I kombination med digital bildanalys kan denna metod på ett tillförlitligt sätt analysera överflöd av proteiner och proteinmodifieringar2. Även om western blot utförs rutinmässigt, är det en tidskrävande och arbetsintensiv metod. Långa inkubationer av antikroppen med membran krävs. Här beskriver vi en ändring av inkubationsmetoden som övervinner denna begränsning utan att offra känsligheten.
Under inkubation av membranet flyter antikroppar i lösning medan antigener immobiliseras på membranet. På grund av deras höga affinitet är antikroppsbindningshastigheten till antigenet snabbare än diffusionen av antikroppar från bulklösningen till membranet. Detta skapar ett lågkoncentrationslager för utarmning (figur 1). Det kan ta timmar för mer avlägsna antikroppar att nå membranet via passiv diffusion, vilket är den viktigaste faktorn som är ansvarig för långa inkubationstider i denna teknik. Denna effekt kallas masstransportbegränsningen (MTL)3. Det har föreslagits att repetitiv tömning och påfyllning av den antikroppsinnehållande lösningen kan störa utarmningsskiktet och övervinna MTL4. Här har vi utarbetat en unik teknik som implementerar detta cykliska dränerings- och påfyllningskoncept (CDR) för att minska effekten av MTL i ett traditionellt västra blotting-protokoll och avsevärt förkorta den nödvändiga inkubationstiden.
För att bibehålla detektionskänsligheten med kort inkubationstid använde vi oss av en immunoreactionförbättrande teknik som accelererar antigenantikroppsreaktionen och därigenom förbättrar signal-till-brusförhållandet5. Många kommersiellt tillgängliga immunreaction förbättra medel (IRE) består av 2 komponenter (lösning 1 och 2, se tabell över material). IRE:s proprietära sammansättning eller verkningsmekanism har inte offentliggjorts, men vi har tidigare funnit att IRE minskade dissociationskonstanten mellan antigenet och antikroppen i solidfasbindningsanalyser, vilket indikerar att ökad affinitet åtminstone delvis är ansvarig för den ökande effekten av IRE6. Kombinationen av CDR med IRE ger ett ultrahöghastighetsprotokoll för västra blotting som minskar hela procedurtiden utan att offra känsligheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western blot är en allmänt använd analytisk teknik för att upptäcka specifika proteiner som utvecklades ~ 40 år sedan7,8. Sedan dess har tekniken fortsatt att utvecklas, med efterföljande innovationer som förbättrar känsligheten, hastigheten och kvantifieringen av tekniken2,9,10,11,12,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av avdelningen för intramural forskning, nationalhjärta, lungor och blodinstitut, nationella hälsoinstitut. S.H. stöddes av Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, och H.N. och K.Y. var av Valor och V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
