אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.
Abstract
אלקטרופורציה ביססה את עצמה כשיטה קריטית להעברת גנים ספציפיים לתאים כדי להבין את תפקודם. כאן, אנו מתארים טכניקת אלקטרופורציה של תא יחיד שממקסמת את היעילות (~ 80%) של טרנספקטציה בגן במבחנה בנוירונים מעכבים מעוררים ומעמדיים בתרבות פרוסת ההיפוקמפוס האורגנוטיפית של העכבר. באמצעות אלקטרודות זכוכית גדולות, נוזל שדרתי מלאכותי המכיל טטרודוטוקסין ופולסים חשמליים קלים, העברנו גן מעניין לנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס CA1 ואינטראורונים מעכבים. יתר על כן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בפרוסות היפוקמפוס בתרבית עד 21 ימים במבחנה ללא ירידה ביעילות transfection, המאפשרת מחקר של שלבים התפתחותיים שונים של תרבות פרוסה. עם העניין הגובר בבחינת הפונקציות המולקולריות של גנים על פני מגוון רחב של סוגי תאים, השיטה שלנו מדגימה גישה אמינה וישירה לתחילת הגנים במבחנה ברקמת מוח העכבר שניתן לבצע עם ציוד וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות קיימות.
Introduction
בביולוגיה מולקולרית, אחד השיקולים החשובים ביותר לחוקר הוא כיצד להעביר גן של עניין לתא או לאוכלוסיית תאים כדי לברוח את תפקידו. שיטות המסירה השונות יכולות להיות מסווגות כביולוגיות (למשל, וקטור ויראלי), כימיות (למשל, סידן פוספט או שומנים), או פיזיות (למשל, אלקטרופורציה, מיקרו-הנדסה או ביוליסטית)1,2. שיטות ביולוגיות יעילות מאוד ויכולות להיות ספציפיות לסוג התא אך מוגבלות על ידי פיתוח של כלים גנטיים ספציפיים. גישות כימיות הן חזקות מאוד במבחנה, אבל transfections הם בדרך כלל אקראיים; יתר על כן, גישות אלה שמורות בעיקר לתאים ראשיים בלבד. מתוך הגישות הפיזיות, הביוליסטיקה היא הפשוטה והקלה ביותר מבחינה טכנית, אך שוב מייצרת תוצאות טרנספקטיות אקראיות ביעילות נמוכה יחסית. עבור יישומים הדורשים העברה לתאים ספציפיים ללא צורך בפיתוח כלים גנטיים, אנו מסתכלים לכיוון אלקטרופורציה חד-תאית3,4.
בעוד אלקטרופורציה המשמשת להתייחס רק אלקטרופורציה שדה, במהלך עשרים השנים האחרונות, פרוטוקולי אלקטרופורציה מרובים במבחנה ו in vivo חד תא פותחו כדי לשפר את הספציפיות ואת היעילות 5,6,7, להוכיח כי electroporation יכול לשמש להעברתגניםלתאים בודדים יכול, ולכן, להיות מדויק מאוד. עם זאת, ההליכים תובעניים מבחינה טכנית, גוזלים זמן רב ולא יעילים יחסית. ואכן, מאמרים עדכניים יותר חקרו את ההיתכנות של אסדות אלקטרופורציה ממוכנות8,9, אשר יכול לעזור לחסל כמה מחסומים אלה לחוקרים המעוניינים להתקין רובוטיקה כזו. אבל עבור אלה המחפשים אמצעים פשוטים יותר, הבעיות עם אלקטרופורציה, כלומר מוות תאים, כשל transfection, וסתימת פיפטה, להישאר דאגה.
לאחרונה פיתחנו שיטת אלקטרופורציה המשתמשת בפיפטות זכוכית בעלות קצה גדול יותר, פרמטרים מתונים יותר של פעימות חשמליות, וצעד רכיבה על אופניים ייחודי בלחץ, שיצר יעילות transfection גבוהה בהרבה בתאי עצב מעוררים מאשר שיטות קודמות, ואיפשר לנו לראשונה להעביר גנים באינטראורונים מעכבים, כולל אינטראורונים מעכבים המבטאים סומטוסטטין באזור CA1 ההיפוקמפוס של תרבות פרוסת האורגנוטיפית של העכבר10. עם זאת, האמינות של שיטת אלקטרופורציה זו בסוגי פנימיות מעכבות שונות ושלבים התפתחותיים עצביים לא טופלה. כאן, הדגמנו שטכניקת אלקטרופורציה זו מסוגלת להעביר גנים הן לנוירונים מעוררים והן למעמדות שונים של אינטראורונים. חשוב לציין, יעילות טרנספקטו הייתה גבוהה ללא קשר לימים במבחנה (DIV) פרוסת גיל תרבות נבדק. טכניקה מבוססת וידידותית למשתמש זו מומלצת מאוד לכל חוקר המעוניין להשתמש באלקטרופורציה של תא יחיד לסוגי תאים שונים בהקשר של רקמת מוח של עכבר במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים כאן שיטת אלקטרופורציה המעבירה נוירונים מעוררים ומעכבים ביעילות ודיוק גבוהים. פרוטוקול האלקטרופורציה הממוטב שלנו כולל שלוש פריצות דרך חדשניות להשגת עבירות גנים יעילות ביותר. השינוי הראשון שלנו היה להגדיל את גודל הפיפטה בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר3,<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות (R01NS085215 כדי K.F., T32 GM107000 ו F30MH122146 ל- A.C.). המחברים מודים לגברת נאו ווטנבה על הסיוע הטכני המיומן.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
Referências
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
