Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

David G. Keener; Amy Cheung; Kensuke Futai

doi:10.3791/61662

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Artigo de método

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

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DOI:

10.3791/61662

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6 de outubro de 2020

David G. Keener^*¹^,² , Amy Cheung^*¹^,³ , Kensuke Futai¹

¹Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, ²Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, ³UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Resumo

A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.

Introdução

Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)¹^,². Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas i....