माउस हिप्पोकैम्पल उत्तेजक और कक्षा-विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन्स की विभिन्न ऑर्गैग्निक स्लाइस संस्कृति में एकल-सेल इलेक्ट्रोपशन
Summary
यहां प्रस्तुत एकल कोशिका इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए एक प्रोटोकॉल है जो इन विट्रो हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृति युगों की एक श्रृंखला में उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स दोनों में जीन प्रदान कर सकता है। हमारा दृष्टिकोण व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन की सटीक और कुशल अभिव्यक्ति प्रदान करता है, जिसका उपयोग कोशिका-स्वायत्त और अंतरकोशिकीय कार्यों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
इलेक्ट्रोपाउशन ने अपने कार्य को समझने के लिए विशिष्ट जीन को कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि के रूप में खुद को स्थापित किया है। यहां, हम एक एकल-कोशिका इलेक्ट्रोप्यूटेशन तकनीक का वर्णन करते हैं जो माउस ऑर्गेनोटीपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस संस्कृति में उत्तेजक और वर्ग-विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन्स में इन विट्रो जीन ट्रांसफेक्शन की दक्षता (~ 80%) को अधिकतम करता है। बड़े ग्लास इलेक्ट्रोड, टेट्रोडोडॉक्सिन युक्त कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ और हल्के विद्युत दालों का उपयोग करके, हमने सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स और निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स में रुचि का एक जीन दिया। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपॉशन को विट्रो में 21 दिनों तक सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल स्लाइस में किया जा सकता है जिसमें ट्रांसफैक्शन दक्षता में कोई कमी नहीं है, जो अलग-अलग स्लाइस संस्कृति विकासात्मक चरणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। कोशिका प्रकार की एक विविध रेंज में जीन के आणविक कार्यों की जांच में बढ़ती रुचि के साथ, हमारी विधि माउस मस्तिष्क ऊतक है कि मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरण और तकनीकों के साथ किया जा सकता है में विट्रो जीन ट्रांसफेक्शन में एक विश्वसनीय और सीधा दृष्टिकोण दर्शाता है ।
Introduction
आणविक जीव विज्ञान में, एक अन्वेषक के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक यह है कि अपने कार्य को स्पष्ट करने के लिए कोशिकाओं या कोशिकाओं की आबादी में ब्याज के जीन को कैसे वितरित किया जाए। प्रसव के विभिन्न तरीकों को या तो जैविक (जैसे, एक वायरल वेक्टर), रासायनिक (जैसे, कैल्शियम फॉस्फेट या लिपिड), या भौतिक (जैसे, इलेक्ट्रोपॉरेशन, माइक्रोइंजेक्शन, या बायोलिस्टिक्स) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है1,2। जैविक विधियां अत्यधिक कुशल हैं और सेल प्रकार-विशिष्ट हो सकती हैं लेकिन विशिष्ट आनुवंशिक उपकरणों के विकास से सीमित हैं। विट्रो में रासायनिक दृष्टिकोण बहुत शक्तिशाली होते हैं, लेकिन ट्रांसफैक्शन आम तौर पर यादृच्छिक होते हैं; इसके अलावा, ये दृष्टिकोण ज्यादातर प्राथमिक कोशिकाओं के लिए ही आरक्षित हैं। भौतिक दृष्टिकोणों में से, बायोलिस्टिक्स तकनीकी दृष्टिकोण से सबसे सरल और आसान है, लेकिन फिर से अपेक्षाकृत कम दक्षता पर यादृच्छिक ट्रांसफैक्शन परिणाम पैदा करता है। उन अनुप्रयोगों के लिए जिन्हें आनुवंशिक उपकरण विकसित करने की आवश्यकता के बिना विशिष्ट कोशिकाओं में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, हम एकल-कोशिका इलेक्ट्रोपाउशन3,4की ओर देखते हैं।
जबकि इलेक्ट्रोपॉशन केवल फील्ड इलेक्ट्रोपॉजेशन को संदर्भित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, पिछले बीस वर्षों में, कई इन विट्रो और वीवो सिंगल-सेल इलेक्ट्रोपाउनेशन प्रोटोकॉल को विशिष्टता और दक्षता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है5,6,7,यह प्रदर्शित करता है कि इलेक्ट्रोपाउशन का उपयोग जीन को व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है और इसलिए, बेहद सटीक हो सकता है। हालांकि, प्रक्रियाएं तकनीकी रूप से मांग कर रही हैं, समय लेने वाली हैं, और अपेक्षाकृत अक्षम हैं। दरअसल, हाल के कागजात ने मशीनीकृत इलेक्ट्रोपॉइपेशन रिग्स8, 9की व्यवहार्यता की जांच की है, जो इस तरह के रोबोटिक्सको स्थापितकरने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए इनमें से कई बाधाओं को खत्म करने में मदद कर सकता है। लेकिन सरल साधनों की तलाश करने वालों के लिए, इलेक्ट्रोपाउशन, अर्थात् सेल डेथ, ट्रांसफैक्शन विफलता और पिपेट क्लोजिंग के साथ समस्याएं चिंता का विषय बनी हुई हैं।
हमने हाल ही में एक इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि विकसित की है जो बड़े इत्तला वाले ग्लास पिपेट का उपयोग करती है, मामूली विद्युत पल्स पैरामीटर, और एक अद्वितीय दबाव साइकिलिंग कदम, जिसने पिछले तरीकों की तुलना में उत्तेजक न्यूरॉन्स में बहुत अधिक ट्रांसफेक्शन दक्षता उत्पन्न की, और हमें पहली बार अवरोधक इंटरन्यूरॉन्स में जीन को स्थानांतरित करने में सक्षम बनाया, जिसमें सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेसिंग अवरोधक इंटरन्यूरॉन्स शामिलहैं। हालांकि, विभिन्न निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन प्रकारों और न्यूरोनल विकासात्मक चरणों में इस इलेक्ट्रोपाउशन विधि की विश्वसनीयता को संबोधित नहीं किया गया है। यहां, हमने दिखा दिया कि यह इलेक्ट्रोप्यूशन तकनीक उत्तेजक न्यूरॉन्स और इंटरन्यूरॉन के विभिन्न वर्गों दोनों में जीन को स्थानांतरित करने में सक्षम है। महत्वपूर्ण बात, विट्रो (DIV) स्लाइस संस्कृति आयु परीक्षण में दिनों की परवाह किए बिना ट्रांसफेक्शन दक्षता उच्च थी। इस स्थापित और उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक इन विट्रो माउस मस्तिष्क ऊतक के संदर्भ में विभिन्न सेल प्रकारों के लिए एकल सेल इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करने में रुचि रखने वाले किसी भी अन्वेषक के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां एक इलेक्ट्रोपॉरेशन विधि का वर्णन करते हैं जो उच्च दक्षता और परिशुद्धता के साथ उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स दोनों को स्थानांतरित करता है। हमारे अनुकूलित इलेक्ट्रोपाउशन प्रोटोकॉल में अत्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों (R01NS085215 से K.F., T32 GM107000 और F30MH122146 से A.C.) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों ने कुशल तकनीकी सहायता के लिए सुश्री नाओई वातानाबे को धन्यवाद दिया ।
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
Referências
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