Isolering af murine spermatogene celler ved hjælp af en Violet-ophidset celle-permeable DNA bindende dye
Summary
Her præsenterer vi en enkel og effektiv metode til at isolere levende meiotiske og post-meiotiske kimceller fra voksne muse testes. Ved hjælp af en lav-cytotoksicitet, violet-ophidset DNA bindende farvestof og fluorescens-aktiveret celle sortering, kan man isolere højt beriget spermatogene cellepopulationer for mange downstream applikationer.
Abstract
Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for at undersøge molekylære mekanismer, der ligger til grund for meiose og spermatogenese. Selv om der er etableret celle isolation protokoller ved hjælp af Hoechst 33342 farvning i kombination med fluorescens-aktiveret celle sortering, det kræver celle sorteringer udstyret med en ultraviolet laser. Her beskriver vi en celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten, en lav cytotoksicitet DNA bindende farvestof strukturelt ligner Hoechst 33342. DCV kan være begejstret for både ultraviolette og violette lasere, hvilket forbedrer fleksibiliteten i udstyr valg, herunder en celle sorterer ikke er udstyret med en ultraviolet laser. Ved hjælp af denne protokol, kan man isolere tre levende celler subpopulationer i meiotiske prophase jeg, herunder leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatider. Vi beskriver også en protokol til fremstilling af encellet suspension fra museekrilerne. Samlet set kræver proceduren en kort tid at gennemføre (4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler), hvilket letter mange downstream-applikationer.
Introduction
Spermatogenese er en kompleksproces,hvor en lille population af spermatogoniale stamceller opretholde kontinuerlig produktion af et stort antal sædceller i hele voksenlivet1,2. Under spermatogenese, dynamisk kromatin remodeling finder sted, når spermatogene celler gennemgå meiose til at producere haploid spermatids3,4,5. Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for molekylær undersøgelse, og der er etableret flere forskellige tilgange til isolering af meiotiske spermatocytter, herunder sedimentationsbaseret adskillelse6,7 og fluorescensaktiv sortering (FACS)8,9,10,11,12,13 , 14,15,16,17. Disse metoder har dog tekniske begrænsninger. Mens sedimentering-baseret adskillelse giver et stort antal celler5,6,7, det er arbejdskrævende. Den etablerede FACS-baserede metode bruger Hoechst 33342 (Ho342) til at adskille meiotiske spermatocytter baseret på DNA-indhold og lysspydende egenskaber og kræver FACS cellesorterer udstyret med en ultraviolet (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserede metoder kræver transgene muselinjer, der udtrykker lysstofproteiner, synkronisering af spermatogenese12eller cellefiksering og antistofmærkning, der ikke er kompatibel med isolering af levende celler13. Mens der er en anden alternativ metode ved hjælp af en celle-permeable DNA bindende farvestof, DyeCycle Grøn plet14,15,16,17, denne metode anbefales til isolering af spermatogene celler fra unge testikler. Derfor er der et kritisk behov for at udvikle en enkel og robust isolationsmetode for levende meiotiske spermatocytter, der kan anvendes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan udføres ved hjælp af enhver FACS cellesortering.
Her beskriver vi sådan en længe søgt celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten. DCV er en lav cytotoksicitet, celle-gennemtrængelig DNA bindende farvestof strukturelt ligner Ho342, men med en excitation spektrum flyttet mod det violette område18. Desuden har DCV et bredere emissionsspektrum i forhold til DCG. Således kan det være ophidset af både UV og violet lasere, som forbedrer fleksibiliteten af udstyr, så brugen af en FACS celle sorterer ikke er udstyret med en UV-laser. DCV-protokollen præsenteret her bruger to-dimensionel adskillelse med DCV blå og DCV rød, efterligne fordelen ved Ho342-protokollen. Med denne fordel giver vores DCV-protokol os mulighed for at isolere højt berigede kimceller fra de voksne testikler. Vi leverer en detaljeret gating protokol til at isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testikler af en mus (fra to testikler). Vi beskriver også en effektiv og hurtig protokol til at forberede encellet suspension fra museealtikere, der kan bruges til denne celleisolering. Proceduren kræver en kort tid at fuldføre (forberedelse af encelle suspension – 1 time, farvning af farvestoffer – 30 min, og celle sortering – 2-3 timer: i alt – 4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler; Figur 1). Efter celleisolering kan en lang række downstream-applikationer, herunder RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, afsluttes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en praktisk og enkel protokol til at isolere subpopulationer af spermatocytter og spermatids fra en enkelt voksen mandlig mus. For at sikre reproducerbarheden af denne protokol er der nogle kritiske trin, der kræver opmærksomhed. Før enzym fordøjelsen, vaske trin har til formål at fjerne interstitielle celler; efter fordøjelsen, dette trin hjælper med at fjerne spermatozoer og snavs. Vask/centrifugering 3 gange er vigtigt. I vores dissociation buffer opskrift, kombinationen af flere forskellige…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjælp; Katie Gerhardt til redigering af manuskriptet; Mary Ann Handel for deling af H1T antistof, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometri Core til deling af FACS udstyr støttet af NIH S10OD023410; Tilskud til videnskabelig forskning (KAKENHI; 17K07424) til T.N. Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship til AS; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprojektet Grant af Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for The Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
Referências
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Biologia do Desenvolvimento. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 557-567 (1995).
