Конъюнктивальная комменсальная изоляция и идентификация у мышей
Summary
Здесь представлен протокол выделения и амплификации аэробных и факультативных анаэробных конъюнктивальных комменсальных бактерий мышей с использованием уникального глазного мазка и этапа обогащения на основе культуры с последующей идентификацией микробиологическими методами и масс-спектрометрией MALDI-TOF.
Abstract
Глазная поверхность когда-то считалась иммунной привилегированной и абиотической, но в последнее время кажется, что существует небольшое, но постоянное комменсальное присутствие. Идентификация и мониторинг видов бактерий в слизистой оболочке глаз были сложными из-за их низкой численности и ограниченной доступности соответствующей методологии для комменсального роста и идентификации. Существует два стандартных подхода: культуральные или методы секвенирования ДНК. Первый метод проблематичен из-за ограниченных восстанавливаемых бактерий, а второй подход идентифицирует как живые, так и мертвые бактерии, что приводит к аберрантному представлению глазного пространства. Мы разработали надежный и чувствительный метод бактериальной изоляции, основываясь на стандартных методах микробиологического культивирования. Это метод на основе тампонов, использующий «лабораторный» тонкий тампон, который нацелен на нижнюю конъюнктиву, за которым следует этап амплификации для аэробных и факультативных анаэробных родов. Этот протокол позволил нам выделить и идентифицировать виды конъюнктивы, такие как Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.и т. Д. Этот подход подходит для определения комменсального разнообразия у мышей в различных условиях заболевания.
Introduction
Целью этого протокола является усиление специфического выделения жизнеспособных и редких аэробных и факультативных анаэробных микробов из глазной конъюнктивы для характеристики глазного микробиома. Обширные исследования профилировали комменсальные сообщества слизистой оболочки на коже, кишечнике, дыхательных и половых путях и показывают, что эти сообщества влияют на развитие иммунной системы и ответ1,2,3. Было показано, что глазные комменсальные сообщества изменяются во время некоторых патологий заболевания, таких как болезнь сухого глаза4,синдром Шегрена5 и диабет6. Тем не менее, способность определять типичную комменсальную общность глазной поверхности затруднена их относительно низким содержанием по сравнению с другими участками слизистойоболочки 6,7,8. Это вызывает споры о том, существует ли резидентный глазной микробиом и если он существует, отличается ли он от микробиома кожи и, следовательно, его местное влияние на развитие и реакцию врожденной иммунной системы. Этот протокол может помочь решить этот вопрос.
Как правило, подходы к определению окулярной комменсальной ниши основаны на методах секвенирования и культуры4,7,9. 16 Секвенирование S рДНК и анализ BRISK7 показывают более широкое разнообразие, чем методы, основанные на культурах, но не могут различать живые и мертвые микробы. Поскольку поверхность глаза враждебна многим микробам из-за антимикробных свойств слезной пленки4, генерирующих большой массив фрагментов ДНК, подходы, основанные на ДНК, будут обнаруживать эти артефакты, которые могут исказить данные в сторону идентификации мертвых бактерий как резидентных комменсалов, а не загрязняющих веществ. Это приводит к аберрантной комменсальной идентификации и характеристике глазного пространства как более высокого по численности и разнообразию микробов10. Это затрудняет определение резидентного глазного микробиома с помощью методов на основе ДНК. Принимая во внимание, что стандартные методы, основанные на культуре, не могут обнаружить комменсалы, потому что нагрузка слишком низкая11. Наш метод улучшает стандартную практику, используя тонкий тампон, который может нацеливаться на конъюнктиву, тем самым избегая загрязнения от соседней кожи, а также концепцию, что жизнеспособные организмы могут быть обогащены кратковременной культурой в питательных плотных средах с целью реанимации жизнеспособных, но не культивируемых, а также обогащения редкими жизнеспособными микробами.
Результаты, относительное обилие глазных комменсалов на глазной мазок, характеризуют конъюнктивный резидентный микробиом и важны для сравнительных целей. Наши данные показывают, что существует разница между микробиотой кожи и конъюнктивы, а также большее разнообразие с увеличением возраста и специфической для пола разницей в изобилии. Кроме того, этот подход воспроизводимо обнаружил комменсальные различия у нокаут-мышей12. Этот протокол может быть применен для описания глазного микробиома, который может варьироваться из-за практики клетки, географии или состояния заболевания, а также местных эффектов комменсальных метаболитов и продуктов на развитие и реакцию иммунной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за пауцибактериального состояния глазной поверхности многие лаборатории испытывали трудности с выделением глазных комменсалов7,20,что приводило к низкому количеству образцов с ростом, низкой численностью и низким разнообразием8. Этот ме…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование от P30 DK034854 поддержало VY, LB и исследования в Массачусетском центре микробиома хозяина, а финансирование от NIH / NEI R01 EY022054 поддержало MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
Referências
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
