В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта
Summary
Здесь мы описываем быструю и прямую методологию скрининга in vivo CRISPR/Cas9 с использованием ультразвукового наведения в эмбриональных инъекциях матки для одновременной оценки функций нескольких генов в коже и полости рта иммунокомпетентных мышей.
Abstract
Генетически модифицированные модели мыши (GEMM) сыграли важную роль в оценке функции генов, моделировании заболеваний человека и служили доклинческой моделью для оценки терапевтических путей. Однако их трудоемкий и трудоемкий характер ограничивает их полезность для систематического анализа генной функции. Последние достижения в области технологий редактирования генома преодолевают эти ограничения и позволяют быстро появляются специфические возмущения генов непосредственно в рамках конкретных органов мыши в мультиплексе и быстрым способом. Здесь мы описываем метод на основе CRISPR/Cas9 (Кластерированный регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы) для создания тысяч генов нокаутированных клонов в эпителии кожи и полости рта мышей, и предоставляем протокол с подробным описанием шагов, необходимых для выполнения прямого экрана in vivo CRISPR для генов супрессора опухоли. Этот подход может быть применен к другим органам или другим технологиям CRISPR/Cas9, таким как активация CRISPR или CRISPR-инактивация для изучения биологической функции генов во время гомеостаза тканей или в различных условиях заболевания.
Introduction
Одна из проблем для исследований рака в пост-геномную эпоху заключается в том, чтобы добывать огромное количество данных генома для причинно-следственных мутаций генов и выявлять узлы в генной сети, которые могут быть направлены терапевтически. Хотя биоинформатический анализ очень помог в достижении этих целей, создание эффективных моделей in vitro и in vivo является необходимым условием для расшифровки сложности биологических систем и состояний болезней и обеспечения разработки лекарственных средств. В то время как обычные трансгенные модели мыши широко используются для исследований генетики рака in vivo, их затратный, трудоемкий характер в значительной степени запрещает систематический анализ сотен генов лечения рака, разгаданых современной геномикой. Чтобы преодолеть это узкое место, мы объединили ранее установленную ультразвуковую методикуредактирования утеро-инъекций 1,2 с CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)технологией редактирования генов 3, чтобы одновременно вызвать и изучить потерю функциональных мутаций сотен генов в коже и полости рта одной мыши.
Описанная здесь методология использует ультразвуковые инъекции инженерных лентивирусов в амниотической полости живых эмбрионов мыши в эмбриональный день E9.5. Лентивирусный груз, содержащий компоненты CRISPR/Cas9, трансдуцирован однослойным поверхностным эктодермом, что впоследствии приводит к эпителию кожи и полости рта. Кожа состоит из внешнего эпидермиса, за которым следуют мембрана подвала и дерма. Эпидермис представляет 16-й стратифицированный эпителий, состоящий из внутреннего базального слоя, который поддерживает контакт с мембраной подвала и имеет пролиферативную и стволовую способность. Базальный слой приводит к дифференцированным слоям выше, таким как спиновые, гранулированные и слои роговицы2,4. Исследования отслеживания линий показывают, что этот метод прямого in vivo CRISPR/Cas9 генетически манипулирует стволовыми клетками резидентов тканей в базальной слое, которые сохраняются на протяжении всей взрослой жизни. Поскольку лентивирус можно заценит для трансдукирования эктодерма поверхности E9.5 при клональной плотности, этот метод может быть использован для генерации мозаичных мышей, укрывающих тысячи дискретных генных нокаутированных клонов. Следующее поколение секвенирования может быть использовано для анализа эффекта CRISPR/Cas9-опосредованная абляция генов в этих клонов в мультиплекснойманере 5.
Недавно мы использовали этот метод для оценки функции 484 генов, которые показывают периодические мутации в человеческой голове и шее плоскоклеточной карциномы (HNSCC)5. HNSCC является разрушительным раком с высоким уровнем смертности 40-50%, и это6-й наиболее распространенный рак во всем мире6. HNSCC возникают в слизистой оболочки верхних дыхательных путей или полости рта и связаны с потреблением табака и алкоголя или вирус папилломы человека (ВПЧ) инфекции. Кожные плоскоклеточный рак (SCC) являются опухоли кожи и представляют собой второй наиболее распространенный рак у людей7. Кожные SCC и HNSCC являются гистограммо и молекулярно очень похожи, с высоким процентом случаев, выставленных изменения в TP53, PIK3CA, NOTCH1, и HRAS8. Хотя существует лишь горстка генов, мутировавших на высокой частоте, существуют сотни генов, мутировавших на низкой частоте (Lt; 5%), явление, обычно называемое распределением длиннохвостых. Поскольку большинство длиннохвостых генов не имеют биологической или клинической проверки, мы использовали эту технологию скрининга in vivo CRISPR для моделирования потери функции этих генов у опухолевых мышей с сенсибилизирующими мутациями в p53, Pik3ca или Hras и определили несколько новых генов супрессоров опухолей, которые сотрудничают с p53, Pik3ca или Hras, чтобы вызвать развитие опухоли 5.
Здесь мы описываем подробный протокол для создания мультиплексных библиотек sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA и выполнения экранов выкриков гена CRISPR/Cas9 в эктодерме поверхности мыши. Следует отметить, что эта методология может быть адаптирована для включения других технологий манипуляции генами, таких как активация CRISPR (CRISPRa) и инактивация CRISPR (CRISPRi) или изменена для целевой других систем органов в мыши для изучения функций генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Редактирование генома CRISPR/Cas9 широко используется в исследованиях in vitro и in vivo для исследования функций генов и клеточных процессов. Большинство исследований in vivo используют генНЫЕ отредактированные клетки CRISPR/Cas9, привитые в модель животного (алотрансплант или ксенотрансплант). Хотя эт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектом гранта Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR 365252), Фонда Крембиля и Исследовательского фонда Онтарио в рамках 8-го раунда (RE08-065). Сампат Кумар Логанатан является получателем стипендии Канадского онкологического общества (BC-F-16-31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
