אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.
השמנת יתר והפרעות מטבוליות כגון סוכרת, מחלות לב וסרטן, כולם קשורים לשיפוץ דרמטי של רקמת השומן. תאים אב שומן תושב רקמה (נגמ”שים) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס רקמת שומן והוא יכול לתרום פתולוגיה רקמה. השימוש הגובר בטכנולוגיות ניתוח תאים בודדים – כולל רצף רנ”א חד-תאי ופרוטאומיקה של תא יחיד – משנה את שדה תאי הגזע/אב בכך שהוא מאפשר רזולוציה חסרת תקדים של שינויים בודדים בביטוי התא בהקשר של שינויים באוכלוסייה או ברקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח רקמת שומן אפידימלית של העכבר, לבודד תאים בודדים שמקורם ברקמת שומן, ולבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להעשיר עבור Sca1+/CD31קיימא –/CD45–/Ter119– נגמ”שים. פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים להכין נגמ”שים באיכות גבוהה המתאימים לניתוחים במורד הזרם כגון רצף RNA של תא יחיד.
רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן1,2. במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתיםקרובות 3,4. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלידם, שבץמוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytesבוגרת 6. מחקרים אחרונים על רצף רנ”א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית7,8,9,10,11,12. לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes7. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור7. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1+ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן7,13 עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ”שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes6,7, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1+/Ter119קיימא –/CD31–/CD45–/DAPI– תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1+/ Linקיימא – תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes7.
רצף RNA של תא יחיד (scRNA-seq) צובר תאוצה במהירות ככלי רב עוצמה לחקור בו זמנית אוכלוסיות תאים מגוונות ברמת התא הבודד. בשל עלויות גבוהות הקשורות להכנת מדגם רצף תפוקה גבוהה, זה הכרחי כדי לייעל את התשומות הסלולר (כדאיות גבוהה וטוהר) כדי להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. פרוטוקולים מסוימים להכנת תאי…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים את מאיו קליניק מיקרוסקופיה ניתוח תאים הליבה Cytometry מתקן לסיוע עם מיון FACS.
1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |