Summary
우리는 L3-L5 가시 과정의 절제술에 의해 요추 추간판 변성 마우스 모델을 개발했으며, 초라 및 간 척추 인대 및 패러시러스 근육의 분리와 함께.
Abstract
추간판 변성(IDD)은 요통으로 이어지는 흔한 병리학적 변화입니다. 적절한 동물 모델은 병리학 적 과정을 이해하고 신약을 평가하기위해 필요합니다. 여기서, 수술 후 1주일부터 IDD를 개발하는 외과적으로 유도된 요추 척추 불안정(LSI) 마우스 모델을 소개했습니다. 상세하게, 마취 하에 마우스는 낮은 허리 피부 절개에 의해 작동되었다, L3-L5 가시 공정 노출, 파라위스 근육의 분리, 프로세스와 인대의 절제술, 피부 폐쇄. L4–L5 IVDs는 관찰을 위해 선택되었다. LSI 모델은 초기 단계에서 엔드플레이트의 다공성 및 비대증에 의한 요추 IDD를 개발하고, 추간판 부피감소, 중간 단계에서핵 펄포스의 수축, 요추척추(L5)의 뼈 손실 등을 개발한다. LSI 마우스 모델은 강력한 조작성, 특수 장비의 요구 사항, 재현성, 저렴하고 상대적으로 짧은 기간의 IDD 개발의 장점이 있습니다. 그러나, LSI 수술은 아직도 첫 주 수술 후 내염증을 일으키는 원인이 되는 외상입니다. 따라서, 이 동물 모델은 요추 IDD의 연구에 적합합니다.
Introduction
무척추 디스크 변성 (IDD)은 일반적으로 노화와 많은 요인에 의해 발생 하는 젊은 사람들1. IDD로 고통받는 환자를 위한 수술은 요통및 손상된 운동을 일으키는 원인이 되는, 일반적으로 나중에 단계 또는 가혹한 경우에 수행되고 비조합 또는 감염2와같은 잠재적인 리스크가 있습니다. 이상적인 비수술적 치료는 IDD 메커니즘에 대한 포괄적인 이해가 필요합니다. IDD 동물 모델은 IDD 메커니즘 의 연구와 IDD 치료 평가를 위한 중요한 도구 역할을 합니다.
더 큰 동물은 영장류, 양, 염소, 개 및 토끼와 같은 IDD 모델에 선택되었습니다. 그러나 이러한 동물 모델은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는9입니다. 마우스 IVD는 종횡비, 핵 펄포스 대 디스크 영역 비율 및 정규화 된높이(10)의기하학적 측정에 기초하여 인간 IVD의 불량 표현이다. 크기 차이에도 불구하고 마우스 요추 IVD 세그먼트는 압축 및 비틀림강성(11)과같은 인간 IVD와 유사한 기계적 특성을 나타낸다. 또한, 마우스 IDD 모델은 저비용, 상대적으로 짧은 IDD 개발, 그리고 추가 기계학 연구에서 활용되는 유전자 변형 동물 및 항체에 대한 더 많은선택권의장점을 가지며12,13,14,15.
실험유도 IDD 모델은 유도제 및 응용 분야마다 다릅니다. 예를 들어, 콜라게나제 유도 세포 외 매트릭스(ECM) 변성은 ECM 재생연구(16)에적합하다. 유전자 변형 표현형은 IDD 프로세스 및 유전요법(17)에서유전자 기능을 연구하는 데 적합하다. Annulus 섬유절개침 및 연기 모델은 외상 및 비염증 유도 IDD12,18을모방한다.
척추 불안정성(SI)은 최적의 평형 상태가 아닌 불안정한 척추로 이어집니다. 인대와 근육과 같은 주변 지지 조직의 약점으로 인해 요추 운동 세그먼트의 비정상적인 이동에 의해 발생할 수 있습니다. 또한 일반적으로 후 척추 융합동작(19)을볼 수 있다. SI는 IDD의 주요 원인으로 간주됩니다. 따라서, 인간 IDD공정(20,21)을모방한 SI 마우스 모델(요추 척추에 초점을맞춘)을개발하는 것을 목표로 한다.
프로토콜에서, 우리는 요추 제 3 (L 3)의 절제술에 의해 요추 척추 불안정성 (LSI) 마우스 모델을 요추 (L5)에요추 (L5)척추 및 간산성 인대(도 1A, B)와함께 가시성 과정으로 확립하는 절차를 도입했다. 동물 모델은 비대와 끝판 (EP)에서 다공성에 의해 표시된 대로 수술 후 1 주 일찍 IDD를 개발합니다. IVD 볼륨감소 시작 2 주 통해 수술 후 주 16 증가 IVD 점수와 함께 주, 이는 IDD의 정도를 나타냅니다. 우리는 상세한 시각화 된 절차가 연구원이 실험실에서 LSI 마우스 모델을 확립하고 필요에 따라 IDD 연구에 적용하는 데 유용하다고 믿습니다.
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Protocol
조사는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 부합하고 전통적인 중국 의학 동물 관리 및 사용 위원회의 상하이 대학에 의해 승인되었습니다 기술되었습니다. 모든 외과 조작은 깊은 마취하에 행해졌고 동물은 시술 도중 어떤 단계에서든 고통을 경험하지 않았습니다.
1. 사전 작동 준비
- 기기 살균: 수술 전 오토클레이브(121°C 15분)에서 스팀 멸균 수술기구. 금속 용기에 악기를 포장하고 수술에 사용될 때까지 유지합니다.
- 수술 플랫폼 설정: 수술에 대해 최소 60cm x 60cm의 벤치 영역을 할당합니다. 75%의 알코올로 표면을 청소하고 일회용 의료 수건으로 덮습니다. 멸균 수술 기구 팩, 시약, 수술 용품을 1/3 상부 내일회용 의료 용 수건에 놓습니다. 나머지 2/3은 수술 수술을 위해 깨끗한 영역을 둡니다. 열 지지대를 위해 수술 용 패드 아래에 핫패드를 추가합니다.
- 동물 제제
- 동물(C57BL/6J 마우스, 수컷, 8주 된 마우스)을 유도실에 놓습니다. 이소플루란의 경우 4%, 산소용 L/min의 유도 수준에서 기화기를 켭니다. 동물이 완전히 마취된 후, 코 콘과 마취성 전달을 이소플루란의 경우 1.5%, 수술 중 산소에 대해 0.4 L/min수준으로 마취를 유지한다. 호흡을 위해 동물을 모니터링합니다.
- 수술 중 각막 건조를 방지하기 위해 염산염염염 눈 연고를 적용하십시오.
- 작은 동물 트리머를 사용하여 상복부 부위의 상부에 낮은 흉부 부위에서 등쪽 표면에 수술 영역을 면도. 티슈 와이프로 면도 된 모피를 제거합니다.
- 탈모 크림을 면도 부위에 바르고 3분 이상 방치하십시오. 크림을 거즈로 제거하고 0.9 % 멸균 식염수의 2 mL로 씻어 냅니다.
- 마우스의 복부 아래에 맞춤형 수술 원통형패드(도 2A)를배치하여 요추를 올리고 수술 작업을 용이하게 한다.
2. 요추 5위(L3-L5)가시 공정에 대한 요추 의 노출
- 검지 손가락을 사용하여 더 바깥쪽인 요추 척추의 피하 척추 공정을 터치하고 흉부 척추 및 대추척추와 비교하여 요추 영역을 식별합니다.
- 75%의 알코올을 사용하여 피부를 헹지. 심근을 드러내기 위해 메스 블레이드를 사용하여 중중 흉부 부위에서 엉덩이까지 목재 부위에 3-4cm 의 중간 피부 절개를 수행합니다.
- 척추 공정의 끝에 삽입된 후방 근막의 형태에 의해 요추 척추를 식별합니다. 세부사항으로, 제1 성추(S1)에 대한 세번째 요추(L3)는"V" 모양에 의해 다른 근막과 구별된다. 마지막 "V" 팁은 첫 번째 천년(S1)근막과 첫 번째 "V" 팁에 연결되어L3 스핀스 공정(그림2B)에해당합니다.
- 메스블레이드(그림 2C)를사용하여 양쪽에 L3에서 L5까지 가시공정을 따라 후방 파라위스 근육 절개를 합니다. 치질을 줄이기 위해 면쪽으로 절개 깊이를 제어합니다.
- L3을 L5 가시 적 과정과 우월성 인대에 노출하는 두 개의 안과 포셉을 사용하여 근육 층을 분리하십시오.
3. 인대와 함께 L3–L5 가시 과정의 절제술
- 금성 가위를 사용하여 중간 인대를 차단하여 개별 가시 프로세스를 분리(그림 2D).
- L3–L5 가시 공정을 금성 가위와 함께 분리한다(그림2E).
- 복역 근육의 재부착없이 멸균 실크 편조 (봉합사 크기 5.0)로 피부 절개를 봉합합니다.
- 수술 부위에 클로테트라사이클린 염산염 눈 연고를 적용하십시오.
- 진통에 대한 LSI 수술 직후 Buprenorphine-SR (마우스 무게의 그램 당 25 uL)를 관리하십시오.
- 동물을 따뜻한 챔버에 놓고 마취에서 회복하는 동안 모니터링하십시오. 동물을 홈 케이지로 되돌리기 전에 음식과 물 섭취량을 모니터링합니다.
- 수술 후 처음 3일 동안 매일 동물을 모니터링합니다. 동물은 정상적인 식욕을 가질 수 있어야 하며 고름, 출혈 또는 붓기의 흔적없이 치유해야합니다. 그(것)들은 운동에 있는 경미한 손상이 있을 수 있습니다.
- L3–L5 척추에서 후방 보역 근육의 분리에 의해서만 가짜 수술을 수행하십시오.
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Representative Results
LSI 마우스 모델은 EP20,21,22,23에서경화증, 감각 내시경 등의 IDD 메커니즘, IDD 처리, 엔드플레이트(EP) 변성의 연구에 적용된다. LSI 마우스는 식별된 IDD 및 EP 퇴행성 변화를 개발하여 IVD 볼륨및 높이 감소, EP 볼륨 증가, IVD 및 EP 점수 증가등을 통해 확인할 수 있습니다.
해부 및 고정 하부 흉부 및 요추 척추는 이전에 설명된20,21과같이 고해상도 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)에 의해 검사되었다. 갈비뼈가 있는 하부 흉부 요추는 L3–L5 척추(그림3A)의식별을 위해 포함되었다. 측면 뷰에서 L3–L5 척추의 엑스레이는 샴 및 LSI 그룹에서 가시 공정의 존재 와 존재를 나타낸다(도3B). 결과는 왼쪽 전방 경사보기(그림3C)에L3-L5 척추의 3D-재구성과 L3–L5 척추(그림 3D)의횡방향 이미지에 의해 더 명확하다.
L4-L5 IVD의 관상 동맥은 IVD20(도 4A)의3D 조직형 분석을 수행하는 데 사용되었다. IVD 부피는 L4와 L5 척추 사이의 전체 보이지 않는 공간을 포함하는 관심 영역(ROI)으로 정의됩니다. 매개 변수: TV(총 조직 부피)가 3D 구조분석(도 4B)에사용되었다. IVD 볼륨은 수술 후 1주 동안 크게 증가하여 도 4C에서관찰된 대로 수술 후 2주에서 16주로 감소하기 시작했다.
IVD 공간의 높이는 전방에서후방(도 4E, G)까지다양했다. LSI는 후방 사이트에 큰 영향을 미쳤습니다. 따라서, IVD 공간의 후방 1/3 관상 평면은 IVD 높이측정(도 4D, E)을위해 선택되었다. IVD 높이는 수술 후 2주에서 16주(도4F)로감소했으며, 이는 IVD 부피(그림4C)의조사 결과와 일치하였다.
L4-L5 IVD 공간의 관상 이미지는 두개골 및 caudal 엔드플레이트(Eps)(그림 5A)의3D 조직형태 분석에 적용되었다. 엔드플레이트(EP) 부피는 척추에 가까운 가시성 뼈판을 커버하도록 정의된다(도5A, B)21. 두개골 EP의 5개의 연속된 이미지의 전방 1/4 관상 평면은 LSI마우스(도 5D)에서두개골 EP 내의 충치증가를 보인 3D 재구성(도5C)에사용되었다. 결과는 또한 0.089(그림5E)보다크거나 동일했던 반구 분리 값의 증가된 비율로 표시되었다. 한편, EP 볼륨은 수술 후 크게 증가(그림 5F). Caudal EP는 LSI에 의해 유사한 표현형을 나타낸다(그림 5G, H),LSI는 EP 비대및 충치의 증가로 이끌어 내는 것을 나타내는.
L5 척추 바디는 액세서리없이 각 L5 척추 몸체의 모든 횡방향 섹션의 윤곽을 그리고 모든 2D 이미지를 3D 모델로 변환하여 재구성되었습니다. 건설 및 분석은 상용 소프트웨어(예: NRecon v1.6 및 CTAn v1.9)로 수행되었습니다. L5 척추의 부피는 수술 후 약간 증가하지만 샴 그룹과 16 주 LSI 그룹(그림 6B)의통계 적 차이만 있습니다. BV/TV의 현저한 감소는 또한 LSI가 나중에 척추 뼈 손실을 일으키는 원인이 된다는 것을 나타내는 수술 후 16 주 제시되었습니다(그림 6A, C).
LSI는 IVD 및 EP 점수증가(24)로 나타난 바와 같이 IVD 변성 및 EP 변성을 유도한다(그림7A,C). 핵 펄포소 세포의 세포 내 비쿨올의 감소는 LSI 군에서 가속화되었다(도7B). 트랩염색(그림 7E,F)에표시된 바와 같이 LSI EP(도7D)의충치 증가와 함께 골세포 수가 증가하였다.
데이터는 s.d를 ± 평균으로 표시되었습니다. 통계적 유의성은 학생의 t-시험에의해 결정되었다. 유의수준은 p< 0.05로 정의되었다. 모든 데이터 분석은 SPSS 15.0을 사용하여 수행되었습니다.
그림 1: LSI 마우스 모델의 회로도. (A)마우스의 허리 영역에서 L3–L5 척추의 해부학. (B)가시성 인대 및 간질 인대 (창백한 표시)와 함께 가시 과정의 절제술. 빨간색 점선은 단면 평면을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: L3–L5 가시 공정 및 LSI 작동의 노출. (A)마우스의 복부 아래에 맞춤형 원통형 패드가 배치됩니다. (B)"V" 형상에 의한 요추 근막의 노출 및 L3 ~ S1 가시 공정의 식별. (C)L3 ~ L5 척추 과정의 양쪽에 측면 파라비시 근육 절개. (D)중간 인대를 차단하여 개별 가시 과정의 노출. (E)L3–L5 척추 과정의 절제술과 간 및 수프라 가시 인대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: μCT에 의한 LSI 식별. (A)L3-L5 척추의 국소화는 X 선에서 흉부 척추를 가진 갈비뼈에 의한 것입니다. (B)측면 뷰상에 엑스레이 및(C)3D 재구성은 샴 및 LSI 그룹에서 L3–L5 척추의 왼쪽 전방 경사뷰에. (D)가시 공정의 절제술과 요추 척추의 횡단 평면. (D)비안 등으로부터수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LSI는 IVD 볼륨을 줄입니다. (A)L4와 L5 EP 사이의 보이지 않는 공간(Red)의 연속 이미지는 3D 재구성에 사용된다. (B)IVD 볼륨은(A)의TV에 의해 정의된다. (C)L4–L5 IVD 볼륨을 작동 후 5개의 시점으로 정량화합니다. 그룹당 N = 8. 데이터는 평균 ± s.d. * p< 0.05, **p & 0.01 대 샴으로 표시됩니다. (D)횡선 평면 및(E)요추 척추 몸의 중간 처진 평면. 파란색 이중 화살표는 전방 직경을 나타냅니다. 노란색 선은 후방 1/3 평면을 나타냅니다. (F)L4–L5의후방 1/3 관상 평면의 5개의 연속 이미지를 사용하여 두개골 및 caudal EP의 재구성. 빨간색은 IVD 공간을 나타냅니다. (G)L4–L5의중간 처질 평면 . (C)비안 등으로부터 수정되었습니다.20. (F,G)비안 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LSI는 EP 비대와 다공성을 유도합니다. (A)L4–L5의코로날 평면 . 빨간색 점선은 3D 구조에 사용되는 caudal EP의 이미지를 나타냅니다. (B)코달 L4 및 두개골 L5의재건 . 파란색 만화는 L4–L5의caudal EP를 나타냅니다. (C)L4–L5의중간 처질 평면 . 파란색 이중 화살표는 전방 직경을 나타냅니다. 노란색 선은 전방 1/4 평면을 나타냅니다. (D)L4-L5의전방 1/4 평면의 5개의 연속 이미지로 두개골 EP의 재구성. (E,G) μCT 분석에서 얻은두개골(E)및 caudal(G) EP의 반구 분리 분포의 백분율. (F,H) 두개골(F)및 코달(H)의정량화. 표시된 시점에서 L4– L5 EP 볼륨. 그룹당 N = 8. 데이터는 평균 ± s.d.* p<, 0.05 대 로 표시됩니다. 가짜. (D-H)비안 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: LSI는 후기 단계에서 척추 뼈 손실을 일으킵니다. (A)16주 샴 및 LSI 그룹에서L5 척추몸의 재건. (B,C) L5 척추 TV(B)와BV / TV(C)의정량화. 그룹당 N = 8. 데이터는 평균 ± s.d.* p< 0.05, ** p< 0.01 대로 표시됩니다. 가짜. (B)비안 등으로부터수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: LSI는 IVD 및 EP 변성으로 이어집니다. (A)IVD 변성의 표시로서 LSI 또는 샴 마우스에서 IVD 점수. (B)L4-L5 IVD에서 NPs에 대한 사프란 오 염색의 대표적인 이미지. 흰색은 바쿨올을 나타냅니다. 빨간색은 프로테오글리칸을 나타냅니다. (C)EP 의 퇴화의 표시로서 LSI 또는 샴 그룹에서 EP 점수. (D)코달 L4–L5 EP에 대한 사프란 O-빠른 녹색 염색의 대표적인 이미지. 녹색/파란색 얼룩 석회화 된 구멍. (E)코달 L4–L5 EP용 트랩 염색의 대표적인 이미지. 보라색은 트랩+ 를나타냅니다. 그룹당 N = 6. 데이터는 평균 ± s.d.* p< 0.05, ** p< 0.01 대로 표시됩니다. 가짜. (F)트랩+ 골의 정량화(E). (A, B)비안 외20에서수정되었습니다. (C-F)비안 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
척추에서 후부 보전근육이 분리되고 척추및 간척추인과 함께 가시공정이 절제된 자궁경부 척추 척추증 마우스 모델을 기반으로 요추증 불안정성을 마우스 모델을개발했다. 우리는 더 눈에 띄는 가시 공정을 가지고 요추 척추에 유사한 작업을 수행했다. LSI 마우스 모델은 요추 척추에서 유사한 IDD를 개발했습니다.
LSI 모델의 장점은 강력한 조작성, 특수 장비의 요구 사항, 재현성 및 IDD 개발의 비교적 짧은 기간을 포함한다.
작업 중 성공률을 개선하기 위해 몇 가지 핵심 사항이 여기에 제시됩니다. 또한 중요한 단계이기도 합니다. 첫째, 상처에 남아있는 면도 된 머리카락이 아나필락시성 반응을 일으킬 수 있기 때문에 가능한 한 명확하게 허리 부분에 머리카락을 제거하십시오. 둘째, 원통형 패드 또는 다른 패드는 요추 척추를 올리는 것이 좋습니다. 셋째, 마이크로 가위를 사용하여 절개 깊이와 출혈을 제어합니다. 혈종 수신경증이 수술 중에 발견되면 수술을 중단하고 마우스가 수술 중 또는 수술 후 생존하지 않기 때문에 마우스를 희생하십시오. 넷째, 파라위스 근육의 재부착은 재부착이 불안정을 만들 수 있기 때문에 권장되지 않습니다. 다섯째, 전체 L3–L5 가시 공정의 전체 절제는 개별 모델의 변동성을 감소시킵니다. 여섯 째, 주변 신경과 혈관을 다치게 하지 마십시오, 그렇지 않으면, 마우스는 비 정수병성 변화를 개발할 수 있습니다. 모델에 표시된 바와 같이 일반적인 표현형을 나타내지 않는 경우 위의 6점을 확인하십시오.
이 LSI 모델의 성공은 작은 동물 MRI 또는 μCT에 의해 측정된 IVD 부피 감소, 조직학적 관찰에 기초한 IVD 점수를 포함하여 2개의 황금 기준에 의해 평가될 수 있다. LSI 모델은 LSI 수술 후 2주 일찍 IDD를 개발하지만, 관찰된 바와 같이 1주초에 최종 판에서 다공성을 개발합니다. 그것은 핵 펄프 수축, 엔드 플레이트 경화증, 골세포 유발 사이토 카인, IDD 유도 골다공증 (16 주 포스트 LSI) 등에 관한 IDD에 대한 연구에 적합합니다.
LSI 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. LSI 수술은 마우스에 대한 상대적으로 큰 외상이다. 염증은 피할 수 없으며 일반적으로 수술 후 7 일 이내에 볼 수 있습니다. 따라서,이 모델은 특히 기계적 적재 변경으로 인한 7 일 이내에 IDD의 초기 병리학 적 변화를 관찰하기에 적합하지 않습니다.
이 모델은 L5와 같은 다른 요추 척추또는 L1에서 L 5까지의 다른 요추를 대상으로 하여 수정할 수있습니다. 건강한 대조군도 샴 그룹 이외에 권장됩니다.
요약하자면, 우리는 외과 로 인한 요추 IDD 마우스 모델을 개발하고 다른 사람들이 동물 모델을 재현하고 IDD 연구에 적용하는 데 도움이되는 절차를 시각화했습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81973607)과 중국 과학기술부로부터 필수 의약품 연구 개발(2019ZX09201004-003-032)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Prevent eye dry, Prevent wound infection |
| C57BL/6J male mice | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Animal model |
| Disposable medical towel | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platform for surgical operation |
| Inhalant anesthesia equipment | MIDMARK | Matrx 3000 | Anesthesia |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Anesthesia |
| Lidocaine hydrochloride | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Pain relief |
| Medical suture needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Suture skin |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | JD1050 | Clip the skin |
| Ophthalmic scissors(10cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | Y00030 | Skin incision |
| silk braided | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Suture skin |
| Small animal trimmer | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Hair removal |
| Sterile surgical blades(12#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Muscle incision |
| Veet hair removal cream | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Hair removal |
| Venus shears | Mingren medical equipment | Length:12.5cm | Clip the muscle and spinous process |
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