Injeção intravitreal e quantitação de parâmetros de infecção em um modelo de rato de endophtalmite bacteriana
Summary
Descrevemos aqui um método de injeção intravitaliana e subsequente quantitação bacteriana no modelo de camundongos de endophthalmite bacteriana. Este protocolo pode ser estendido para medir as respostas imunes do hospedeiro e a expressão genética bacteriana e hospedeira.
Abstract
Infecções bacterianas intraoculares são um perigo para a visão. Pesquisadores usam modelos animais para investigar os fatores hospedeiros e bacterianos e vias de resposta imune associadas à infecção para identificar alvos terapêuticos viáveis e testar drogas para prevenir a cegueira. A técnica de injeção intravitreal é usada para injetar organismos, drogas ou outras substâncias diretamente na cavidade vítrea no segmento posterior do olho. Aqui, demonstramos essa técnica de injeção para iniciar a infecção no olho do rato e a técnica de quantificar bactérias intraoculares. Bacillus cereus foi cultivado em mídia líquida de infusão cardíaca cerebral por 18 horas e resuspended a uma concentração de 100 unidades formadoras de colônias (UFC)/0,5 μL. Um rato C57BL/6J foi anestesiado usando uma combinação de cetamina e xilazina. Usando um microinjetor picoliter e agulhas capilares de vidro, 0,5 μL da suspensão bacilo foi injetado no vitreous médio do olho do rato. O olho de controle contralateral foi injetado com mídia estéril (controle cirúrgico) ou não foi injetado (controle absoluto). Às 10 horas após a infecção, os camundongos foram eutanizados, e os olhos foram colhidos usando pinças cirúrgicas estéreis e colocadas em um tubo contendo 400 μL estéreis PBS e 1 mm de vidro estéril. Para os ensaios ELISAs ou mieloperoxidase, o inibidor de proteinase foi adicionado aos tubos. Para extração de RNA, foi adicionado o tampão de lise apropriado. Os olhos foram homogeneizados em um homogeneizador de tecido por 1-2 minutos. Os homogeneizadores foram diluídos em 10 vezes em PBS e faixa diluída em placas de ágar. O restante dos homogeneizadores foi armazenado a -80 °C para ensaios adicionais. As placas foram incubadas por 24 horas e a UFC por olho foi quantificada. Essas técnicas resultam em infecções reprodutíveis nos olhos do camundongo e facilitam a quantitação de bactérias viáveis, a resposta imune hospedeira e a omics da expressão genética hospedeira e bacteriana.
Introduction
A endophtalmite bacteriana é uma infecção devastadora que causa inflamação e, se não tratada corretamente, pode resultar em perda de visão ou cegueira. Endophtalmite resulta da entrada de bactérias no interior do olho1,2,3,4,5. Uma vez no olho, as bactérias se replicam, produzem toxinas e outros fatores nocivos, e podem causar danos irreversíveis a delicadas células e tecidos da retina. Danos oculares também podem ser causados por inflamação, devido à ativação de vias inflamatórias que levam ao influxo de células inflamatórias no interior do olho1,5,6. A endophtalmite pode ocorrer após cirurgia intraocular (pós-operatório), lesão penetrante no olho (pós-traumática), ou de propagação metastática de bactérias no olho de um sítio anatômico diferente (endógeno)7,8,9,10. Os tratamentos para endophtalmite bacteriana incluem antibióticos, anti-inflamatórios ou intervenção cirúrgica3,4,11. Mesmo com esses tratamentos, a visão ou o próprio olho podem ser perdidos. O prognóstico visual após a endophthalmitis bacteriana geralmente varia dependendo da eficácia do tratamento, da acuidade visual na apresentação e da virulência do organismo infectante.
Bacillus cereus (B. cereus)é um dos principais patógenos bacterianos que causa endophthalmite pós-traumática7,12. A maioria dos casos de endophthalmitis de B. cereus tem um curso rápido, que pode resultar em cegueira dentro de alguns dias. As marcas de Endophthalmitis B. cereus incluem inflamação intraocular em rápida evolução, dor ocular, perda rápida de acuidade visual e febre. B. cereus cresce rapidamente no olho em comparação com outras bactérias que comumente causam infecções oculares2,4,12 e possui muitos fatores de virulência. Portanto, a janela para intervenção terapêutica bem sucedida é relativamente curta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Os tratamentos para esta infecção geralmente são bem sucedidos no tratamento da endophthalmitis causada por outros patógenos menos virulentos, mas b. cereus endophthalmitis geralmente resulta em mais de 70% dos pacientes que sofrem de perda significativa da visão. Cerca de 50% desses pacientes são submetidos à evisceração ou enucleação do olho infectado7,16,22,23. A natureza destrutiva e rápida da endophthalmitis de B. cereus exige tratamento imediato e adequado. Avanços recentes no discernimento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de doenças identificaram potenciais metas de intervenção19,26,27. Modelos experimentais de camundongos de Endophthalmitis B. cereus continuam a ser úteis para discernir os mecanismos de infecção e testar potenciais terapêuticas que possam prevenir a perda de visão.
A infecção intraocular experimental de camundongos com B. cereus tem sido um modelo instrumental para a compreensão de fatores bacterianos e hospedeiros, bem como suas interações, durante a endophthalmite28. Este modelo imita um evento pós-traumático ou pós-operatório, no qual bactérias são introduzidas no olho durante uma lesão. Este modelo é altamente reprodutível e tem sido útil para testar terapias experimentais e fornecer dados para melhorias no padrão de atenção1,6,19,29,30. Como muitos outros modelos de infecção, este modelo permite o controle independente de muitos parâmetros de infecção e permite um exame eficiente e reprodutível dos desfechos de infecção. Estudos em modelo semelhante em coelhos nas últimas décadas examinaram os efeitos dos fatores de virulência de B. cereus no olho2,4,13,14,31. Ao injetar cepas mutantes B. cereus sem fatores individuais ou múltiplos de virulência, a contribuição desses fatores de virulência para a gravidade da doença pode ser medida por desfechos como a concentração de bactérias em diferentes horas de pós-infecção ou a perda da função visual13,14,27,31,32. Além disso, fatores hospedeiros foram examinados neste modelo infectando cepas de camundongos nocauteados sem fatores de hospedeiro inflamatórios específicos26,29,33,34,35. O modelo também é útil para testar tratamentos potenciais para esta doença injetando novos compostos no olho após a infecção30,36. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado que inclui infectar um olho de rato com B. cereus,colher o olho após infecção, quantificar a carga bacteriana intraocular e preservar espécimes para avaliar parâmetros adicionais de gravidade da doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesmo com a disponibilidade de antibióticos potentes, anti-inflamatórios e cirurgia de vitrectomia, a endophtalmite bacteriana pode cegar um paciente. Estudos clínicos têm sido úteis no estudo da endophthalmite; no entanto, modelos experimentais de endophthalmitis proporcionam resultados rápidos e reprodutíveis que podem ser traduzidos para o progresso no padrão de cuidado, resultando em melhor resultado visual para os pacientes.
O volume vítreo do olho do rato é de aproximadamente 7…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Feng Li e Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por sua ajuda. Nossa pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde bolsas R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 e R01EY024140. Nossa pesquisa também foi apoiada pelo P30EY21725 (bolsa NIH CORE para Imagem e Análise De Animais Vivos, Biologia Molecular e Imagem Celular). Nossa pesquisa também foi apoiada pelo programa de pré-doutorado NEI Vision Science 5T32EY023202, uma bolsa de apoio à pesquisa da Fundação Presbiteriana de Saúde e uma bolsa irrestrita ao Instituto Desaprocurado A. McGee Eye de Pesquisa para Prevenir a Cegueira.
Materials
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
Referências
- Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
- Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
- Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
- Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
- Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
- Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
- Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
- Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
- Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
- Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
- Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
- Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
- Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
- Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
- Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
- Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
- Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
- Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
- Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
- Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
- Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
- David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
- Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
- Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
- Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
- Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
- Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
- Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
- LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
- Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
- Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
- Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
- Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
- Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
- Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
- LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
- Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
- Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
- Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
- Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
- Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
- Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
- Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
- Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
- Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).
