Интравитреальная инъекция и количественная оценка параметров инфекции в мышиной модели бактериального эндофтальмита

Summary

Здесь описан метод интравитреальной инъекции и последующей бактериальной количественной оценки в мышиной модели бактериального эндофтальмита. Этот протокол может быть расширен для измерения иммунных реакций хозяина и бактериальной и экспрессии генов-хозяина.

Abstract

Внутриглазные бактериальные инфекции представляют опасность для зрения. Исследователи используют модели животных для исследования принимающих и бактериальных факторов и путей иммунного ответа, связанных с инфекцией, для выявления жизнеспособных терапевтических целей и тестирования препаратов для предотвращения слепоты. Метод внутривитреальной инъекции используется для инъекций организмов, лекарств или других веществ непосредственно в стекловидную полость в задней части глаза. Здесь мы продемонстрировали этот метод инъекций, чтобы инициировать инфекцию в глазу мыши и метод количественной оценки внутриглазных бактерий. Bacillus cereus выращивался в жидком средстве инфузии сердца мозга в течение 18 часов и перерасходулся в концентрацию 100 единиц формирования колонии (CFU)/0,5 МЛ. Мышь C57BL/6J была анестезирована с помощью комбинации кетамина и ксилазина. Используя микроинжектор пиколитера и стеклянные капиллярные иглы, 0,5 мкл подвески Bacillus был введен в середине стекловидного глаза мыши. Контралатеральный контрольный глаз либо вводили стерильными средствами (хирургический контроль), либо не вводили (абсолютный контроль). В 10 часов после заражения мышей усыпляли, а глаза собирали с помощью стерильных хирургических пинцетов и помещали в трубку, содержащую стерильные PBS 400 МЛ и 1 мм стерильные стеклянные бусины. Для анализов ELISAs или миелопероксидазы в трубки был добавлен ингибитор протеиназы. Для извлечения РНК был добавлен соответствующий буфер лиза. Глаза гомогенизировались в тканевом гомогенизаторе в течение 1-2 минут. Гомогенаты были последовательно разбавлены 10 раз в PBS и трек разбавленных на агар пластин. Остальные гомогенаты хранились при -80 градусов по Цельсию для дополнительных анализов. Плиты были инкубированы в течение 24 часов и CFU на глаз был количественно. Эти методы приводят к воспроизводимым инфекциям в глазах мыши и облегчают количественную оценку жизнеспособных бактерий, иммунного ответа хозяина и омиков экспрессии генов хозяина и бактерий.

Introduction

Бактериальный эндофтальмит является разрушительной инфекцией, которая вызывает воспаление, и, если не лечить должным образом, может привести к потере зрения или слепоты. Эндофтальмит является результатом проникновения бактерий в^{внутреннюю часть глаза 1,2,3,4,5.} Оказавшись в глазу, бактерии размножаются, производят токсины и другие вредные факторы, и может привести к необратимым повреждениям тонких клеток сетчатки и тканей. Повреждение глаз также может быть вызвано воспалением, из-за активации воспалительных путей, ведущих к воспалительному притоку^{клеток в внутреннюю часть глаза 1,5,6.} Эндофтальмит может возникнуть после внутриглазной хирургии (послеоперационной), проникающей травмы глаза (посттравматического), или от метастатического распространения бактерий в глаз из другого анатомического участка (эндогенного)^7,8,9,10. Лечение бактериального эндофтальмита включает антибиотики, противовоспалительные препараты или хирургическое^{вмешательство 3,4,11.} Даже с этими процедурами, зрение или сам глаз могут быть потеряны. Визуальный прогноз после бактериального эндофтальмита обычно варьируется в зависимости от эффективности лечения, остроты зрения при презентации и вирулентности инфекционного организма.

Bacillus cereus (B. cereus) является одним из основных бактериальных патогенов, который вызывает посттравматический^{эндофтальмит 7,12}. Большинство случаев эндофтальмита B. cereus имеют быстрый курс, который может привести к слепоте в течение нескольких дней. Отличительными чертами эндофтальмита B. cereus являются быстро развивающееся внутриглазное воспаление, боль в глазах, быстрая потеря остроты зрения и лихорадка. B. cereus быстро растет в глазу по сравнению с другими бактериями, которые обычно вызывают^{глазные инфекции 2,4,12} и обладает многими факторами вирулентности. Таким образом, окно для успешного терапевтического^{вмешательства относительно короткое 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25.} Лечение этой инфекции, как правило, успешно в лечении эндофтальмита, вызванного другими менее вирулентных патогенов, но B. cereus эндофтальмит обычно приводит к более чем 70% пациентов, страдающих от значительной потери зрения. Около 50% из этих пациентов проходят evisceration или enucleation инфицированного^{глаза 7,16,22,23}. Разрушительный и быстрый характер эндофтальмита B. cereus требует немедленного и надлежащего лечения. Недавний прогресс в различение основных механизмов развития болезни определили потенциальные цели для^{вмешательства 19,26,27}. Экспериментальные модели мыши B. cereus эндофтальмит продолжают быть полезными в распознавании механизмов инфекции и тестирования потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить потерю зрения.

Экспериментальная внутриглазная инфекция мышей с B. cereus была инструментальной моделью для понимания бактериальных и принимающих факторов, а также их взаимодействий, во время эндофтальмита²⁸. Эта модель имитирует посттравматическое или послеоперационное событие, при котором бактерии вводятся в глаз во время травмы. Эта модель очень воспроизводится и была полезна для тестирования экспериментальной терапии и предоставления данных^{для улучшения стандарта ухода 1,6,19,29,30}. Как и многие другие модели инфекции, эта модель позволяет осуществлять независимый контроль над многими параметрами инфекции и позволяет эффективно и воспроизводимое обследование исходов инфекции. Исследования в аналогичной модели у кроликов за последние несколько десятилетий изучили влияние факторов вирулентности B. cereus ^{в глазу 2,4,13,14,31}. Путем впрыскивать напряжения мутанта B. cereus нуждаясь индивидуальных или множественных факторах вирулентности, вклад этих факторов вирулентности к суровости заболевания можно измерить исходами such as концентрация бактерий на по-разному часах postinfection или потеря визуально^{функции 13,14,27,31,32.} Кроме того, принимающие факторы были изучены в этой модели, заражая нокаутом штаммов мыши не хватает^{конкретных воспалительных факторов хозяина 26,29,33,34,35}. Модель также полезна для тестирования потенциальных методов лечения этого заболевания путем введения новых соединений в глаз после^{заражения 30,36}. В этой рукописи мы описываем подробный протокол, который включает в себя заражение мышеловки B. cereus,сбор глаз после инфекции, количественную оценку внутриглазной бактериальной нагрузки и сохранение образцов для анализа дополнительных параметров тяжести заболевания.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и исследования зрения. Протоколы были одоб…

Representative Results

Создание воспроизводимой инокулы и точность процедуры внутривитреальной инъекции являются ключевыми шагами в разработке моделей микробного эндофтальмита. Здесь мы продемонстрировали процедуру внутривитреальной инъекции с помощью Грам-положительного Bacillus cereus. Мы ввели 100 CFU/0,5 ?…

Discussion

Даже при наличии мощных антибиотиков, противовоспалительных препаратов и витректомии, бактериальный эндофтальмит может ослепить пациента. Клинические исследования были полезны в изучении эндофтальмита; однако экспериментальные модели эндофтальмита обеспечивают быстрые и воспроиз…

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA