टी और बी सेल रिसेप्टर प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची विश्लेषण अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल रक्त के नमूनों और आंतों की बायोप्सी से डीएनए अलगाव, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए टीसीआरएनए और आईएच पीसीआर पुस्तकालयों की पीढ़ी, एक एनजीएस रन के प्रदर्शन और बुनियादी डेटा विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
प्रतिरक्षा स्मृति, अनुकूली प्रतिरक्षा की पहचान, टी और बी लिम्फोसाइट्स द्वारा करवाया जाता है। संचलन और विभिन्न अंगों में, अरबों अद्वितीय टी और बी सेल क्लोन हैं, और हर एक एक विशिष्ट एंटीजन को बांध सकता है, जिससे प्रसार, भेदभाव और/या साइटोकिन स्राव होता है । टी और बी कोशिकाओं में विशाल विषमता विभिन्न आनुवंशिक खंडों के यादृच्छिक पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न होती है। पिछले दशक में विकसित अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकियां टी और बी सेल रिसेप्टर प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के अभूतपूर्व गहन दृष्टिकोण को सक्षम करती हैं । विभिन्न भड़काऊ स्थितियों, इम्यूनोडेफिसिएन्स, संक्रमण और घातक में अध्ययनों ने क्लोनलिटी, जीन उपयोग और प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के जैव भौतिक गुणों में उल्लेखनीय परिवर्तन का प्रदर्शन किया, जो विभिन्न विकारों में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
यहां, हम रक्त और ऊतक से टी और बी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के NGS के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से डीएनए अलगाव से शुरू एक पाइपलाइन पेश करते हैं, NGS सीक्वेंसर पर अनुक्रमण और बुनियादी विश्लेषणों के साथ समाप्त होता है। यह विधि न्यूक्लियोटाइड या अमीनो-एसिड स्तर पर विशिष्ट टी और बी कोशिकाओं की खोज में सक्षम बनाती है, और इस प्रकार विभिन्न रोगों में लिम्फोसाइट आबादी और विविधता मापदंडों में गतिशील परिवर्तनों की पहचान कर सकती है। यह तकनीक धीरे-धीरे नैदानिक अभ्यास में प्रवेश कर रही है और इसमें उपन्यास बायोमार्कर, जोखिम स्तरीकरण और सटीक दवा की पहचान करने की क्षमता है।
Introduction
अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, टी और बी लिम्फोसाइट्स के शामिल, इम्यूनोलॉजिकल स्मृति का उपयोग करने के लिए एक पहले का सामना करना पड़ा एंटीजन पहचान और एक तेजी से प्रतिक्रिया शुरू । लिम्फोसाइट्स बोन मैरो में उत्पन्न होते हैं और थाइमस (टी कोशिकाओं) या बोन मैरो (बी कोशिकाओं) में परिपक्व होते हैं। टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) दोनों अद्वितीय विन्यास प्रदर्शित करते हैं जो विशिष्ट एंटीजन की मान्यता की अनुमति देते हैं। होमोस्टेसिस में, टी और बी कोशिकाएं एंटीजन-पेश कोशिकाओं पर प्रस्तुत अरबों विभिन्न पेप्टाइड्स को लगातार प्रसारित और सर्वेक्षण करती हैं। उच्च आत्मीयता के साथ एक विशिष्ट एंटीजन का टीसीआर या बीसीआर लिगेशन, उचित सह-उत्तेजना के साथ, सेल सक्रियण की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बी कोशिकाओं के मामले में साइटोकिन स्राव, क्लोनल विस्तार और एंटीबॉडी का उत्पादन होता है।
विभिन्न टी या बी कोशिकाओं की विशाल सरणी को सामूहिक रूप से प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची कहा जाता है, जिससे अनगिनत विभिन्न एपिटोप्स की मान्यता मिलती है। इस तरह के विशाल प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने के लिए, विभिन्न जीन खंडों की यादृच्छिक असेंबली की एक जटिल प्रक्रिया होती है, जो रिसेप्टर्स के लगभग अंतहीन संयोजन पैदा करती है जो अद्वितीय एंटीजन1को बांध सकती है। वी (डी) जे पुनर्संयोजन नामक इस प्रक्रिया में विभिन्न चर (वी), विविधता (डी) और जॉइनिंग (जे) जीन की पुनर्व्यवस्था शामिल है, जिसमें जंक्शनों2में न्यूक्लियोटाइड के यादृच्छिक विलोपन और सम्मिलन शामिल हैं।
अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की वास्तुकला कई दशकों के लिए विभिन्न क्षेत्रों में रुचि वैज्ञानिकों है। अतीत में, सेंगर अनुक्रमण, पूरक निर्धारण क्षेत्र 3 (सीडीआर 3) स्पेक्ट्राटाइटिंग, और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची की विशेषता के लिए किया जाता था, लेकिन कम रिज़ॉल्यूशन प्रदान किया जाता था। पिछले दशक में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियों में प्रगति ने किसी व्यक्ति की टीसीआर और बीसीआर प्रदर्शन3,4की विशेषताओं और संरचना में गहराई से अंतर्दृष्टि प्राप्त की। ये उच्च-थ्रूपुट सिस्टम (एचटीएस) अनुक्रम और लाखों पुनर्व्यवस्थित टीसीआर या बीसीआर उत्पादों को एक साथ संसाधित करते हैं और न्यूक्लियोटाइड या अमीनो एसिड स्तर पर विशिष्ट टी और बी कोशिकाओं के उच्च-संकल्प विश्लेषण की अनुमति देते हैं। NGS स्वास्थ्य और रोग दोनों में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का अध्ययन करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान करता है । एचटीएस का उपयोग करने वाले अध्ययनों में ऑटोइम्यून रोगों में टीसीआर और बीसीआर प्रदर्शनों का प्रदर्शन किया गया5,प्राथमिक इम्यूनोडेफिसिएंसी6,7और घातक, जैसे कि एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया8। एनजीएस का उपयोग करते हुए, हमने और अन्य लोगों ने भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) वाले रोगियों में विशिष्ट टी और बी सेल क्लोन का अल्पाधिकार विस्तार दिखाया है, जिसमें अल्सर कोलाइटिस और क्रोन की बीमारी9,10,11,12, 13,14शामिल हैं। कुल मिलाकर, विभिन्न क्षेत्रों के अध्ययनों से पता चलता है कि प्रदर्शनों की सूची में परिवर्तन प्रतिरक्षा मध्यस्थता विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल आंतों की बायोप्सी और रक्त से डीएनए के अलगाव के लिए एक विधि, TCRο और घा पीसीआर पुस्तकालयों के उत्पादन के लिए NGS के लिए, और अनुक्रमण रन के प्रदर्शन का वर्णन करता है । हम प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची डेटा विश्लेषण में बुनियादी कदम भी प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से TCRα, TCRγ, और IGL पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है। विधि अन्य अंगों (जैसे, लिम्फ नोड्स, ट्यूमर, सिनोवियल तरल पदार्थ, वसा ऊतक, आदि) के साथ भी संगत है जब तक कि ऊतक-विशिष्ट पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बी और टी लिम्फोसाइट्स के बहुतायत और कार्य में परिवर्तन अक्सर विभिन्न घातक18,पुराने भड़काऊ विकारों (जैसे, अल्सर कोलाइटिस और रूमेटॉयड गठिया)10,19और विभिन्न इम्यूनोडेफिसिएंसी<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
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