Analisi del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B utilizzando il sequenziamento di nuova generazione
Summary
L’attuale protocollo descrive un metodo per l’isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali, generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per il sequenziamento di nuova generazione, le prestazioni di una corsa NGS e l’analisi dei dati di base.
Abstract
La memoria immunologica, il segno distintivo dell’immunità adattiva, è orchestrata da linfociti T e B. In circolazione e in diversi organi, ci sono miliardi di cloni di cellule T e B unici, e ognuno può legare uno specifico antigene, portando alla proliferazione, differenziazione e / o secrezione di citochine. La vasta eterogeneità nelle cellule T e B è generata dalla ricombinazione casuale di diversi segmenti genetici. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), sviluppate nell’ultimo decennio, consentono una visione approfondita senza precedenti del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B. Studi in varie condizioni infiammatorie, immunodeficienze, infezioni e neoplasie maligne hanno dimostrato marcati cambiamenti nella clonalità, nell’uso genico e nelle proprietà biofisiche del repertorio immunitario, fornendo importanti approfondimenti sul ruolo delle risposte immunitarie adattive nei diversi disturbi.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per NGS del repertorio immunitario delle cellule T e B dal sangue e dai tessuti. Presentiamo una pipeline che parte dall’isolamento del DNA attraverso la preparazione della libreria, sequenziamento sul sequencer NGS e termina con analisi di base. Questo metodo consente l’esplorazione di specifiche cellule T e B a livello nucleotidico o amminoacido, e quindi può identificare cambiamenti dinamici nelle popolazioni di linfociti e parametri di diversità in diverse malattie. Questa tecnica sta lentamente entrando nella pratica clinica e ha il potenziale per l’identificazione di nuovi biomarcatori, stratificazione del rischio e medicina di precisione.
Introduction
Il sistema immunitario adattivo, composto da linfociti T e B, utilizza la memoria immunologica per riconoscere un antigene precedentemente incontrato e avviare una risposta rapida. I linfociti sono generati nel midollo osseo e maturano nel timo (cellule T) o nel midollo osseo (cellule B). Sia il recettore delle cellule T (TCR) che il recettore delle cellule B (BCR) mostrano configurazioni uniche che consentono il riconoscimento di antigeni specifici. Nell’omeostasi, le cellule T e B circolano e rilevano costantemente i trilioni di diversi peptidi presentati sulle cellule che presentano antigeni. La legazione TCR o BCR di un antigene specifico ad alta affinità, insieme ad un’adeguata co-stimolazione, porta all’attivazione cellulare, con conseguente secrezione di citochine, espansione clonale e generazione di anticorpi, nel caso delle cellule B.
L’enorme gamma delle diverse cellule T o B è collettivamente definita repertorio immunitario, consentendo il riconoscimento di innumerevoli epitopi diversi. Al fine di generare un repertorio così vasto, si svolge un complesso processo di assemblaggio casuale di diversi segmenti genico, creando combinazioni quasi infinite di recettori in grado di legare antigeniunici 1. Questo processo, chiamato ricombinazione V(D)J, include riarrangiamenti di diversi geni variabili (V), diversità (D) e unione (J), accompagnati da deezioni casuali e inserimenti di nucleotidi nellegiunzioni 2.
L’architettura del sistema immunitario adattivo ha interessato scienziati in diversi campi per molti decenni. In passato, il sequenziamento di Sanger, lo spettrotipizzazione complementare della regione determinante 3 (CDR3) e la citometria del flusso erano usati per caratterizzare il repertorio immunitario, ma fornivano una bassa risoluzione. Nell’ultimo decennio, i progressi nei metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno permesso una visione approfondita delle caratteristiche e della composizione dei repertori TCR e BCR di unindividuo 3,4. Questi sistemi ad alta produttività (HTS) sequenziano ed elaborano contemporaneamente milioni di prodotti TCR o BCR riorganizzati e consentono un’analisi ad alta risoluzione di specifiche cellule T e B a livello di nucleotide o amminoacidi. NGS fornisce una nuova strategia per studiare il repertorio immunitario sia in salute che in malattia. Gli studi che utilizzano HTS hanno dimostrato repertori TCR e BCR alterati nelle malattie autoimmuni5,immunodeficienze primarie6,7e neoplasie maligne, come nella leucemia mieloide acuta8. Utilizzando NGS, noi e altri abbiamo mostrato l’espansione oligoclonale di specifici cloni cellulari T e B, in pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), tra cui colite ulcerosa e malattia di Crohn9,10,11,12,13,14. Nel complesso, studi provenienti da diversi campi suggeriscono che i cambiamenti nel repertorio hanno un ruolo cruciale nella patogenesi dei disturbi immuno-mediati.
L’attuale protocollo descrive un metodo per l’isolamento del DNA dalle biopsie intestinali e dal sangue, la generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per NGS e le prestazioni di sequenziamento. Forniamo anche passaggi di base nell’analisi dei dati del repertorio immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la generazione di librerie TCRα, TCRγ e IGL. Il metodo è anche compatibile con altri organi (ad esempio linfonodi, tumori, liquido sinoviale, tessuto adiposo, ecc.) purché siano utilizzati protocolli di digestione specifici per i tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
I cambiamenti nell’abbondanza e nella funzione dei linfociti B e T si incontrano spesso in diverse neoplasie maligne18,disturbi infiammatori cronici (ad esempio colite ulcerosa e artrite reumatoide)10,19e in varie immunodeficienze17,20. Il metodo attuale utilizza NGS per facilitare una visione approfondita dei repertori TCR e BCR, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nessuno.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
Referências
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
