T- och B-cellsreceptor immunrepertoaranalys med nästa generations sekvensering
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för DNA-isolering från blodprover och tarmbiopsier, generering av TCRβ och IGH PCR-bibliotek för nästa generations sekvensering, prestanda för en NGS-körning och grundläggande dataanalys.
Abstract
Immunologiskt minne, kännetecknet för adaptiv immunitet, orkestreras av T och B lymfocyter. I omlopp och olika organ finns det miljarder unika T- och B-cellkloner, och var och en kan binda ett specifikt antigen, vilket leder till spridning, differentiering och / eller cytokinutsöndring. Den stora heterogeniteten i T- och B-celler genereras av slumpmässig rekombination av olika genetiska segment. Nästa generations sekvenseringsteknologier (NGS), som utvecklats under det senaste decenniet, möjliggör en oöverträffad djupgående syn på T- och B-cellreceptorns immunrepertoar. Studier i olika inflammatoriska tillstånd, immunbrist, infektioner och maligniteter visade markanta förändringar i klonalitet, genanvändning och biofysiska egenskaper hos immunrepertoaren, vilket ger viktiga insikter om rollen av adaptiva immunsvar vid olika sjukdomar.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för NGS av immunrepertoar av T- och B-celler från blod och vävnad. Vi presenterar en pipeline som utgäcks från DNA-isolering genom biblioteksförberedelse, sekvensering på NGS sequencer och slutar med grundläggande analyser. Denna metod möjliggör utforskning av specifika T- och B-celler på nukleotid- eller aminosyranivå, och kan därmed identifiera dynamiska förändringar i lymfocytpopulationer och mångfaldsparametrar i olika sjukdomar. Denna teknik går långsamt in i klinisk praxis och har potential att identifiera nya biomarkörer, riskstratifiering och precisionsmedicin.
Introduction
Det adaptiva immunsystemet, som består av T- och B-lymfocyter, använder immunologiskt minne för att känna igen ett tidigare påträffat antigen och initiera ett snabbt svar. Lymfocyter genereras i benmärgen och mognar i tymus (T-celler) eller benmärg (B-celler). Både T-cellsreceptorn (TCR) och B-cellreceptorn (BCR) visar unika konfigurationer som möjliggör igenkänning av specifika antigener. I homeostas cirkulerar T- och B-celler ständigt och undersöker biljonerna av olika peptider som presenteras på antigen-presenterande celler. TCR- eller BCR-ligatur av ett specifikt antigen med hög affinitet, tillsammans med lämplig kostimulering, leder till cellaktivering, vilket resulterar i cytokinutsöndring, klonurspansion och generering av antikroppar, när det gäller B-celler.
Det enorma utbudet av de olika T- eller B-cellerna kallas kollektivt immunrepertoar, vilket möjliggör erkännande av otaliga olika epitoper. För att generera en så stor repertoar sker en komplex process av slumpmässig montering av olika gensegment, vilket skapar nästan oändliga kombinationer av receptorer som kan binda unika antigener1. Denna process, kallad V(D)J rekombination, omfattar omorganiseringar av olika variabel (V), mångfald (D) och sammanfogning (J) gener, åtföljd av slumpmässiga borttagningar och införanden av nukleotider i korsningarna2.
Det adaptiva immunsystemets arkitektur har intresserat forskare inom olika områden i många årtionden. Tidigare användes Sanger sekvensering, kompletterande bestämma region 3 (CDR3) spektratypning och flöde cytometri för att karakterisera immun repertoaren, men gav låg upplösning. Under det senaste decenniet möjliggjorde framsteg i nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) djupgående inblick i egenskaperna och sammansättningen av en individs TCR- och BCR-repertoarer3,4. Dessa högupplösta system (HTS) sekvens och bearbeta miljontals omorganiserade TCR- eller BCR-produkter samtidigt och möjliggör en högupplöst analys av specifika T- och B-celler på nukleotid- eller aminosyranivå. NGS ger en ny strategi för att studera immunrepertoaren i både hälsa och sjukdom. Studier med HTS visade ändrade TCR och BCR repertoarer i autoimmunasjukdomar 5,primära immunbrister6,7,och maligniteter, såsom i akut myeloisk leukemi8. Med hjälp av NGS har vi och andra visat oligoklonal expansion av specifika T- och B-cellkloner, hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), inklusive ulcerös kolit och Crohns sjukdom9,10,11,12,13,14. Sammantaget tyder studier från olika områden på att förändringar i repertoaren har en avgörande roll i patogenesen vid immunmedierade sjukdomar.
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för isolering av DNA från intestinala tarmbiopsier och blod, generering av TCRβ och IGH PCR bibliotek för NGS och prestanda av sekvensering kör. Vi tillhandahåller också grundläggande steg i immunrepertoardataanalys. Detta protokoll kan också tillämpas för generering av TCRα-, TCRγ- och IGL-bibliotek. Metoden är också kompatibel med andra organ (t.ex. lymfkörtlar, tumörer, synovialvätska, fettvävnad etc.) så länge vävnadsspecifika matsmältningsprotokoll används.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förändringar i överflöd och funktion av B och T lymfocyter påträffas ofta i olika maligniteter18,kronisk inflammatoriska störningar (t.ex. ulcerös kolit och reumatoid artrit)10,19, och i olika immunbrister17,20. Den nuvarande metoden använder NGS för att underlätta en djupgående vy av TCR- och BCR-repertoarer, vilket möjliggör upptäckt av subtila förändringar i T- …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ingen.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
Referências
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
