Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

Summary

We beschrijven de voorbereiding van linten van seriële secties en hun verzameling op grote overdrachtsondersteuning voor gebruik als Array Tomography-monsters, samen met geautomatiseerde beeldvormingsprocedures in een scanning elektronenmicroscoop. Het protocol maakt screening, retrieval en gerichte beeldvorming van lokale, zeldzame gebeurtenissen en de verwerving van grote gegevensvolumes mogelijk.

Abstract

Elektronenmicroscopie wordt toegepast in de biologie en geneeskunde voor beeldvorming van cellulaire en structurele details met nanometerresolutie. Historisch gezien gaf Transmission Electron Microscopy (TEM) inzicht in cel ultrastructuur, maar in het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) de manier van kijken in de cellen veranderd. Hoewel de resolutie van TEM superieur is wanneer structurele details op eiwitniveau nodig zijn, is SEM-resolutie voldoende voor de meerderheid van de celbiologiegerelateerde vragen op organelniveau. De technologische vooruitgang maakte automatische volume-acquisitieoplossingen mogelijk, zoals Serial block-face imaging (SBF-SEM) en Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Niettemin blijven deze methoden tot op de dag van vandaag inefficiënt wanneer de identificatie en navigatie naar interessegebieden cruciaal zijn. Zonder de middelen voor nauwkeurige lokalisatie van doelgebieden vóór beeldvorming, moeten operators veel meer gegevens verzamelen dan ze nodig hebben (in SBF-SEM), of, erger nog, veel rasters voorbereiden en ze allemaal in beeld brengen (in TEM). We stellen de strategie voor van “laterale screening” met behulp van Array Tomography in SEM, die de lokalisatie van interessegebieden vergemakkelijkt, gevolgd door geautomatiseerde beeldvorming van de relevante fractie van het totale monstervolume. Arraytomografiemonsters worden bewaard tijdens het afbeelden en kunnen worden gerangschikt in sectiebibliotheken die klaar zijn voor herhaalde beeldvorming. Er worden verschillende voorbeelden getoond waarin laterale screening ons in staat stelt om structurele details te analyseren die ongelooflijk moeilijk toegankelijk zijn met een andere methode.

Introduction

Ondanks het belang van EM-gerelateerde technieken, houdt de inspanning die nodig is om ze onder de knie te krijgen het hele veld beperkt tot een klein aantal specialisten. Een belangrijke moeilijkheid is het identificeren en ophalen van een regio van belang (ROI) in de monsters die voor EM zijn bewaard. Het uiterlijk van hetzelfde monster verschilt aanzienlijk bij analyse door optische microscopie en na verwerking voor EM-observatie. De veranderingen voor chemisch bereide monsters omvatten de anisotrope monsterkrimp na de uitdrogingsstappen (~ 10% in elke dimensie) en het verlies van fluorescentie bij gebruik van osmium in het fixatie- en kleuringsprotocol(figuur 1A). Voor de ultradunne sectie worden de monsters ingebed in epoxy- of acrylharsen met behulp van verschillende strategieën(figuur 1B). Voor een succesvol resultaat van dit preparaat moet het gehele monster worden gefractioneerd in stukken die niet groter zijn dan 1 mm x 1 mm. Om te voldoen aan de vereisten van de standaard Transmission Electron Microscopy (TEM) observatievoorwaarden, wordt dit kleine deel van het monster verder gesegmenteerd tot plakken van 50-150 nm dik. De resulterende grijswaardenbeelden tonen weefselorganisatie en organelstructuur van een minuscule fractie van het gehele monster met meer detail dan enige andere microscopietechniek (figuur 1C). Een typische TEM-dataset biedt 2D-informatie, theoretisch geëxtrapoleerd om de processen te begrijpen die van nature voorkomen in een 3D-ruimte in cellen en weefsels. Figuur 1D toont de uitdaging van ultrastructurele volumes acquisitie: als een kubus van zijde 1.000 μm wordt doorsneden op een dikte van 50 nm, zijn 20.000 secties nodig om het hele volume te bedekken; voor een zijkubus van 500 μm zijn het 10.000 secties. Om een volume van 50 μm x 50 μm x 50 μm te dekken, kunnen 1.000 secties “slechts” nodig zijn. Het handmatig verkrijgen van dit volume is praktisch onmogelijk en uiterst uitdagend om uit te voeren met automatisering. Als we, naast de diepte van het monster, het volledige oppervlak van dergelijke hypothetische kubussen moeten bedekken, wordt de dekking van het oppervlak van 1^{μm 2} met een redelijke resolutie een ernstig logistiek probleem(figuur 1E). Terwijl voor de buitengewone grootschalige projecten, zoals connectomics-benaderingen, het grote aantal secties cruciaal is, vormt voor de meerderheid van de “alledaagse” EM-projecten het genereren van meer secties die nodig zijn voor de observatie een aanzienlijk nadeel.

Er zijn verschillende methoden om 3D ultrastructurele informatie te verkrijgen: serial sectioning Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomography, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). Belangrijkste verschillen tussen deze methoden zijn de sectiestrategie en of de beeldacquisitie gekoppeld is aan sectiegeneratie¹. Bij seriële sectie-TEM worden sequentiële secties verzameld op sleufrasters, TEM-afbeeldingen worden gegenereerd uit deze reeksen en uitgelijnd^2,3,4,5. In TEM-tomografie bieden kantelseries van 150-300 nm secties op een raster, en wanneer gekoppeld aan seriële secties, een zeer hoge resolutie, hoewel relatief kleine volumes^6,7,8. De AT-benadering maakt gebruik van fysieke secties met diverse handmatige en semi-automatische manieren van sectieverzameling op relatief grote ondersteuning, zoals glazen afdekplaat, siliciumwafers of een speciale tape. Voor beeldacquisitie wordt de ondersteuning geanalyseerd in SEM, met verschillende beeldacquisitiestrategieën zijn beschikbaar^{9,10,11,12,13,14,15.} Voor SBF-SEM wordt fysieke sectie bereikt met behulp van een mini-microtoom met een diamantmes dat direct in de SEM-kamer is geplaatst, waarbij het SEM-beeld wordt gegenereerd vanaf het oppervlak van het harsblok^16,17,18,19. Voor FIB-SEM verwijdert de ionenbron dunne lagen van het monster, gevolgd door automatische beeldvorming van het blootgestelde oppervlak door de SEM^20,21. TEM-tomografie en de AT genereren fysieke secties, die indien nodig opnieuw in beeld kunnen worden gebracht, terwijl FSBF-SEM en FIB-SEM de sectie na beeldvorming elimineren. Een recente combinatie van fysieke secties afgebeeld door een multi-beam SEM biedt een combinatie van methoden die het “bottleneck” -probleem van de snelheid van beeldacquisitie oplost²². Elk van deze technieken heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop EM-gegevens kunnen worden verkregen en geanalyseerd, en elke benadering heeft zijn praktische effecten met betrekking tot een bepaalde onderzoeksvraag.

Gezien de aard van het preparaat en de schaal van de ultrastructurele dimensies, is het niet eenvoudig te voorspellen waar een specifieke doelstructuur zich in het monsterblok bevindt (Figuur 1D,E). Een oplossing voor de ROI-lokalisatie is het vastleggen van de beelden uit het hele blok met de gewenste resolutie vanaf het begin. De structuren van belang kunnen zich in het verkregen gegevensvolume bevinden wanneer ze niet van de microscoop verwijderd zijn. Acquisitietijd en gegevensverwerking in verband met deze strategie zijn problematisch. Het is wenselijk om de hoeveelheid geregistreerde gegevens te verminderen, vooral als de ROI’s veel kleiner zijn dan het weefselblok, d.w.z. als de objecten van belang specifieke soorten cellen zijn (geen hele organen). Verschillende correlatieve licht- en elektronenmicroscopietechnieken (CLEM) kunnen succesvol zijn wanneer de fluorescentie wordt bewaard en gelokaliseerd voor of na de bereiding binnen hetzelfde monster^{23,24,25,26,27,28,29.} Niettemin zijn veel cellulaire structuren herkenbaar, zelfs zonder fluorescentiecorrelatie, alleen gebaseerd op de bekende ultrastructuur. Voor deze gevallen zijn we van mening dat laterale screening Array Tomography een balansafweging biedt tussen de inspanning die is geïnvesteerd in ROI-lokalisatie en de ultrastructurele informatiekwaliteit. Met behulp van deze strategie wordt binnen regelmatige tussenpozen een subset van secties op de wafer gescreend, die kunnen worden vastgesteld op basis van de grootte en aard van de ROI. Zodra ROI’s zijn gevonden, wordt gegevensverzameling opgezet in een continue reeks secties die beginnen voor en eindigen na de ankersectie, waarbij de relevante informatie op een gerichte manier wordt verzameld.

We presenteren protocollen voor AT die de acquisitie van regio’s of evenementen van belang in tal van secties vereenvoudigen en versnellen en beter uitgelijnde beeldvolumes opleveren. Laterale screening en multistep acquisitie produceren gegevens met een zeer hoge resolutie in precies gerichte regio’s. De procedure die we beschrijven, behandelt verschillende uitdagingen van 3D EM-gegevensverzameling, omdat deze voorziet in: compatibiliteit met een breed scala aan monsters zonder de workflow voor monstervoorbereiding fundamenteel te veranderen; gerichte lokalisatie voor sectie- en SEM-acquisities; minder tijd en moeite tijdens de installatie; beeldvorming van regio’s in meerdere secties met een betere uitlijning van de resulterende volumes; en een soepele stik- en uitlijningsprocedure om verschillende afbeeldingen samen te stellen tot een gestikt mozaïekbeeld. We kozen ervoor om de kracht van onze methode aan te tonen met verschillende voorbeelden van gepubliceerde en lopende projecten. Wij zijn van mening dat deze aanpak het genereren en verwerven van gerichte EM-gegevens aanzienlijk kan vergemakkelijken, zelfs voor onderzoekers met beperkte EM-ervaring.

Protocol

OPMERKING: De methoden voor monstervoorbereiding worden elders beschreven14,30,31en worden in deze publicatie niet behandeld. Kortom, de getoonde voorbeelden werden chemisch gefixeerd met glutaaraldehyde, nagefixeerd met 1% OsO4en vervolgens behandeld met 1% waterig uranylacetaat voordat het in de embedhars werd ingebed. Als alternatief kunnen monsters worden bereid met behulp van hogedrukvriezen, bevriezen vervangen door 0,1% uranylacetaat in aceton en ingebed in acrylhars. Monsterblokken werden bereid met behulp van een vlakke inbeddingsmethode die een duidelijk zicht op het monster mogelijk maakt, waardoor de oriëntatie voor de sectie wordt vergemakkelijkt(figuur 1B). 1. Procedure voor het genereren van arrays Ingesloten monsteroriëntatie en bijsnijden Identificeer en markeer met behulp van de verrekijker / microscoop de ROI op het ingebedde blokoppervlak door het oppervlak van het blok lichtjes te krassen met een scheermesje. Dit zal helpen om het monster in de ultramicrotoom te oriënteren en zal het sectieoppervlak verminderen. Klem het monster op de ultramicrotoomhouder (figuur 2A). Snijd de hars rond het monster, eerst met het scheermesje (ruw trimmen) en ga verder met het diamantsnijgereedschap (fijn trimmen; Figuur 2A). Gebruik messen met een randneiging van 20° of 90° om ervoor te zorgen dat de boven- en onderkant van het blok evenwijdig zijn aan de snijkant van het mes.OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor seriële secties en de verwerving van rechte linten. Meng xyleen en lijm in 3:1 verhouding. Met een wimper bevestigd aan een tandenstoker, breng dit mengsel aan op de boven- en de onderkant van het bijgesneden blok. Laat het goed drogen. Bereid de arraymontagesteun A voor (d.w.z. siliciumwafers). Knip het waferstuk met behulp van een wafer cleaving tool (EMS) en pas de grootte aan het projectdoel aan. 2 cm x 4 cm is handig voor zowel licht- als elektronenmicroscopiewaarnemingen. Reinig de wafer in gedestilleerd water om het vuil te verwijderen. Gloeie-ontlading/plasma reinigt het oppervlak met behulp van standaardapparatuur. De precieze parameters zijn afhankelijk van de gebruikte machine. Begin met de parameters voor de afvoer van de netten en pas de tijd empirisch aan. Deze stap is cruciaal voor een goede spreiding van de secties op de ondersteuning terwijl secties drogen en mag niet worden weggelaten. Bereid de montagesteun B van de arrays voor (d.w.z. glazen afdekplaat) Als u multiplex immuno-labeling experimenten plant, breng de monsters dan over op een coverslip om het fluorescentiesignaal beter te detecteren. Om de kleefkracht van coverslip te verbeteren, gebruikt u een gedetailleerde gelatinecoatingprocedure die eerder is beschreven9. Verhoog de geleidbaarheid door de glaasjes te coaten met het indium-tinoxide (ITO) of goud door verdamping. Bewaar de voorbereide coverslips in een schone omgeving. Gloeiend ontlaadt de monsters zoals beschreven in punt 1.2.3. 2. Doorsnede van het monster AT mesbereidingOPMERKING: Gebruik voor het genereren van de arrays een gemodificeerd mes (ATS), ontworpen om de verwerving van lange linten te vergemakkelijken. Histo-Jumbo messen of soortgelijke messen die zijn ontworpen voor het genereren van de secties op grote steunen kunnen ook dienen voor AT-secties. Bevestig de naald aan de onderkant van het mes met behulp van de schuimende plakband en doorboort deze(figuur 2B). Plaats het ATS-mes op 0° in de ultramicrotomehouder. Stel de rand van het mes evenwijdig aan het blokoppervlak in met behulp van de standaardprocedure. Breng het bijgesneden blok naar de rand van het mes in een positie die klaar is voor sectie. Plaats de wafer/coverslip in het mesbassin en vul deze met water tot hetzelfde niveau als de mesrand. Laat de diamantrand van het mes goed bevochtigen en zuig indien nodig water op met de bijgevoegde spuit(figuur 2C). Arraysectie en -overdracht Stel de microtoom in op de gewenste snijparameters. Met het ATS-mes is het bereik van 50-100 nm en een snijsnelheid van 0,6-1 mm / s aan te raden. Begin met secties maken (Figuur 2Di). Verkrijg een lint van de lengte dat een gericht z-volume bedekt en stop de verzameling. Afhankelijk van de blokgrootte, homogeniteit van het weefsel en het type hars, zal het lint relatief recht zijn (Figuur 2D-ii). Veel monsters zullen geen rechte linten produceren, ondanks de geïnvesteerde inspanning en het type mes dat wordt gebruikt. Afhankelijk van het einddoel, maak je een lang of meerdere korte linten naast elkaar uitgelijnd. Een steun van 2 cm x 4 cm kan gemakkelijk 100 tot 1.000 secties bevatten. De opstelling van het lint op de steunstap is een stap die behendigheid en vaste handen vereist. De leercurve voor deze vaardigheid wordt echter snel verworven. Maak het lint los van de mesrand met behulp van een schone, niet-kleverige punt van een wimper die op de tandenstoker is gelijmd(figuur 2Diii). Gebruik de wimper en beweeg het lint voorzichtig boven het midden van het steunmedium. Gebruik op dit punt chloroform of verwarmingspen voor het uitrekken van de secties indien nodig. Vergeet echter niet dat deze manipulatie kan leiden tot het breken en vervormen van linten. Begin met het aftappen van het water door aan de spuit te trekken. Voor delicatere linten of een langzamere waterterugtrekking, laat u water druppelen door de spuit van de slang los te maken. Wanneer het waterniveau daalt tot het waferniveau, controleert u het lint en verplaatst u het indien nodig door het lint voorzichtig naar het midden te duwen. Nadat u de linten op het waferoppervlak hebt geplaatst, gaat u door met draineren totdat het resterende water volledig uit het bassin is teruggetrokken.OPMERKING: Als u het ATS-mes met intreksel van het bodemwater niet gebruikt, verminder dan voorzichtig het water van de zijkanten van het ATS-mes om geen turbulentie te veroorzaken. Laat de delen op de steun in het bad om volledig te laten drogen. Afhankelijk van de hydrofobiciteit van de ondersteuning en de omgevingsvochtigheid, zal water met een andere snelheid verdampen(figuur 2Div). Het is belangrijk om het monster langzaam te laten drogen om alle plooien op het monster te verminderen of helemaal te vermijden. Breng het droge monster over in een goed gesloten doos ter bescherming tegen vuilverontreiniging en plaats het gedurende ten minste 30 minuten in een oven van 60 °C. Indien nodig, counterstain secties met behulp van zware metalen om het algehele contrast te verbeteren. Reinig het mes aan het einde van de procedure voorzichtig volgens de instructies van de fabrikantOPMERKING: De overdracht van meerdere of seriële secties op een wafer(figuur 2E)in vergelijking met de overdracht op een slotraster(figuur 2F)verandert de EM-voorbereidingservaring volledig. De ononderbroken sectie en verzameling van de secties op enkele ondersteuning vermindert de hoeveelheid sectie- en sectieverzamelingsgerelateerde fouten die vaak voorkomen bij seriële secties. Het equivalent van 100 secties van 1000 μm x 500 μm verzameld op één wafer komt overeen met 33 slotroosters (Figuur 2G). 3. Observatie van het monster OPMERKING: In dit gedeelte worden de workflowstappen beschreven zoals geïmplementeerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (zie Tabel met materialen). Elke beeldacquisitiesoftware op elke SEM die is uitgerust met de juiste detectoren kan worden gebruikt, maar de specifieke gebruikersacties zullen verschillen en zullen vaak handmatiger zijn. Verkrijg een overzichtskaart van SEM-afbeeldingen die sectielocaties op de wafer onthult. Een ingebouwde optische cameraafbeelding helpt bij het definiëren van een SEM-beeldmozaïek dat een lint van secties of alle secties bedekt. Maak het mozaïek door met de muis rechts op de cameraafbeelding van het monster te klikken en te slepen en de automatische acquisitie testarten.OPMERKING: Zeer grove beeldvormingsinstellingen, d.w.z. 1-2 μm pixelgrootte en 1 μs verblijftijd volstaan. Dit proces wordt geïllustreerd in Aanvullend materiaal (pagina 2-7). Zoek secties met de functie Automatische detectie van sectiezoeker of zoek ze handmatig. Sectieposities en contouren worden automatisch opgehaald met deze software op basis van beeldmatching. Ter illustratie van dit proces, zie Aanvullend Materiaal (pagina’s 8 – 15). Als de overzichtsafbeeldingen de ROI’s niet duidelijk weergeven, moet u afbeeldingen met een hogere resolutie van secties verkrijgen. Gebruik de functie Sectievoorbeeld om automatisch afbeeldingen te maken en te verkrijgen. Dit proces wordt geïllustreerd in Aanvullend Materiaal,pagina 16-18. Beeldinstellingen moeten worden gekozen op basis van de aard en grootte van de ROI waarnaar de gebruiker zoekt. Om optimale instellingen te vinden, activeert u de Live Imaging in de microscoopbesturingssoftware en navigeert u naar één ROI. Wijzig de beeldinstellingen totdat de afbeeldingen ROIs duidelijk laten zien, maar de beeldacquisitie is niet overdreven lang. Afbeeldingsgebieden definiërenOPMERKING: Er worden verschillende strategieën voorgesteld. Als slechts een paar secties moeten worden afgebeeld, gebruikt u de afbeeldingen van secties die tot nu toe zijn gemaakt om naar de relevante secties te navigeren en gebruikt u de zoombare viewer die alle verkregen afbeeldingen op hun oorspronkelijke relatieve locaties toont om alle secties te bekijken. Zodra een sectie is gevonden die met hoge resolutie moet worden afgebeeld, maakt u een afbeeldingsgebied met klikken en slepen. Kies beeldinstellingen met hoge resolutie en sla de instellingen op in een sjabloon. Hergebruik deze sjabloon voor verdere secties. Om bijzonder kleine of moeilijk te detecteren zeldzame voorvallen te vinden, gebruikt u de laterale screeningsbenadering. Maak handmatig een beeldgebied met hoge resolutie beeldinstellingen op elke tiende sectie of op één sectie per lint en verkrijg de afbeeldingen. Bekijk de afbeeldingen en markeer secties die de ROI in de software bevatten of maak een notitie. Ga uit van secties die de ROI bevatten, navigeer vooruit en achteruit door de sectieset en maak afbeeldingsgebieden met hoge resolutie op dezelfde relatieve locaties zolang de structuur nog zichtbaar is in de sectie. Dit kan handmatig worden gedaan of met behulp van de procedure die in de volgende stappen wordt beschreven. Verkrijg afbeeldingen in meer dan tien opeenvolgende secties. Klik op Verfijning van positie starten nadat u inzoomt op de afbeelding om de precisie van geregistreerde sectielocaties te vergroten, zoals beschreven in de handleiding. Hierdoor neemt de positievariabiliteit van beeldreeksen af. De procedure wordt geïllustreerd en uitgelegd in aanvullend materiaal pagina’s 19-21. Klik en sleep op een sectie om een afbeeldingsgebied te definiëren terwijl u de Alt-toets ingedrukt houdt en selecteer Tegelsetarray maken in het contextmenu dat wordt geopend wanneer de muisknop wordt losgelaten. De software maakt vervolgens beeldgebieden op dezelfde relatieve locatie in alle secties die eerder zijn gevonden of gemarkeerd. Het is mogelijk om de beeldvorming te beperken tot een specifiek bereik van secties met de schuifregelaar Sectiebereik.OPMERKING: Deze procedure kan worden herhaald met een willekeurig aantal beeldgebieden en maakt het daarom mogelijk om veel kleine afbeeldingen met een hoge resolutie op te nemen in plaats van een enkele grotere afbeelding op elke sectie op te nemen. Eenmaal gemaakt, stelt u het aantal pixels, de pixelgrootte, de tegellay-out, de pixelverblijftijd, enz. in elke afbeeldingsreeks in als dat nodig is. Zodra beeldreeksen zijn gemaakt en ingesteld, worden ze allemaal vermeld in een taakcue. Automatische functies configureren en de verwerving van afbeeldingen starten Maak een afzonderlijke afbeeldingsreeks voor automatische functies met dezelfde methode als beschreven in de vorige stap. Verplaats de afbeeldingsreeks naar een positie op de sectie die structuren met een hoog contrast bevat. Stel de afbeeldingsreeks in op 1024 x 884 pixels en kies een pixelgrootte die overeenkomt met de hoogste resolutie die wordt gebruikt in de afbeeldingsreeks die in de vorige stappen is ingesteld. Vink in de lijst met automatische functies Auto Focus en Auto Stigmator aan. Selecteer Op sectie in de besturingselementen voor acquisitievolgorde en zorg ervoor dat de afbeelding met automatische functies het eerste item in de lijst is. Start de afbeeldingsverwerving door op de knop Uitvoeren naast de taakcue te klikken. Deze procedures worden geïllustreerd in Aanvullend materiaal,pagina’s 22-23.OPMERKING: Het is niet nodig om handmatig vooraf scherp te stellen op elke sectie. Tijdens de opnamesessie, wanneer de microscoop naar een nieuwe sectie gaat, worden de automatische functies uitgevoerd voordat alle andere beelden in deze sectie worden opgenomen. 4. Afstemming en analyse van gegevens Gegevens exporteren Zorg ervoor dat gegevens in .tif-indeling worden opgeslagen, zodat er geen speciale exportfunctie nodig is. Sorteer gegevens in een mappenstructuur die rechtstreeks overeenkomt met de lagen en elementen in de lagenstructuur. Zodra afbeeldingsmozaïeken zijn opgenomen, gebruikt u de StitchAll-functie om alle tegels automatisch te naaien. Stapeluitlijning en bijsnijden in FijiNOTITIE. Veel softwarepakketten (gratis en commercieel) kunnen worden gebruikt om met Array Tomography-gegevens te werken. De onderstaande stappen worden weergegeven met het open-sourceprogramma Fiji32 omdat het algemeen beschikbaar is en alle vereiste functies bevat. Importeer een stapel afbeeldingen (of samengevoegde afbeeldingen) in Fiji als een virtuele stapel. Als contrast/helderheid moet worden genormaliseerd, kiest u Verbeterd contrast… in het menu Proces. Stel Verzadigde pixels in op 0,1 of minder en schakel Alle segmenten verwerken in. Kies in het menu Plug-ins de optie Registratie | Lineaire stack-uitlijning met SIFT. Kies Rigid of Affine in het vervolgkeuzemenu Verwachte transformatie. Bewaar anders de standaardinstellingen. Start de uitlijning door op OKte klikken.OPMERKING: Door de gegevens als Virtual Stack te laden, kan Fiji stapels van elke grootte verwerken. De uitvoer van de uitlijning wordt gemaakt in RAM; Dit kan echter de maximale grootte van stapels die kunnen worden verwerkt beperken. Gebruik in dat geval Register Virtual Stack Slices, een map-naar-map implementatie van hetzelfde registratiealgoritme. Zodra de registratie is voltooid, laadt u de uitvoergegevens als een virtuele stack. Snijd de afbeeldingsstapel bij door op Bijsnijden te klikken zodat deze alleen de ROI bevat. Sla de stapel op als één .tif afbeelding of reeks .tif afbeeldingen.OPMERKING: Kritieke stappen van Array Tomography worden weergegeven in Figuur 3.

Representative Results

De onderstaande voorbeelden zijn bedoeld om de veelzijdigheid van de aanbevolen workflows aan te tonen. De case study illustraties zijn projecten waarvoor we moeite hadden om bevredigende resultaten te behalen met andere technieken. We kozen Drosophila adult om typische uitdagingen te illustreren die men zou kunnen tegenkomen met verschillende soorten monsters. Dit buisvormige orgaan van ongeveer 6 mm lang, 500-1000 μm in doorsnede, is verdeeld in verschillende regio’s met een unieke functie en cellulaire samenstelling (Figuur 4A)33. Afhankelijk van de sectierichting variëren de afmetingen van het darmprofiel en het uiterlijk op de sectie. Dwars- of langswaarts georiënteerde secties zijn relatief groot en slechts een paar kunnen op een enkel TEM-raster worden geplaatst(figuur 2F). Slechts een klein deel van het weefsel kan in de FIB worden afgebeeld en voor de SBF-SEM is de moeilijkheid vergelijkbaar met alle niet-homogene monsters. AT biedt een efficiënte afweging voor de analyse van dergelijke monsters en vlakke inbedding vergemakkelijkt de ROI-lokalisatie. Het zorgvuldig trimmen van het teveel aan hars rond het geselecteerde gebied (Figuur 4B) is belangrijk voor een efficiënte verzameling van de arrays uit het relevante gebied (Figuur 4C). Honderden secties kunnen achtereenvolgens of willekeurig op een enkele wafer worden verzameld(figuur 4D). Afhankelijk van de onderzoeksvraag zal voor steekproefscreening en -acquisitie een andere strategie nodig zijn, die we arbitrair in verschillende scenario’s hebben verdeeld. Om verschillende gepresenteerde scenario’s gerichter te illustreren, kozen we verschillende case studies uit het verschillende onderzoeksproject. Analyse van talrijke willekeurig verdeelde grote structuren met een bereik van 1-10 μm (Figuur 4E)Vaak zijn ultrastructurele gegevens nodig om een hypothese te valideren die is voortgekomen uit verschillende experimentele benaderingen, waarbij een standaard en experimenteel veranderde toestand worden vergeleken. In deze gevallen worden verschillende secties meestal willekeurig verzameld op rasters en gescreend om de interessegebieden te lokaliseren en in beeld te brengen. Deze tactiek is meestal minder systematisch en beperkt tot een klein aantal geanalyseerde secties. We raden u aan om overzichten van tientallen / honderden secties met gemiddelde resolutie van een bepaald lint op te nemen(figuur 4D). Voor typische secties van 70 nm zullen 200 secties ongeveer 14 μm beslaan, die talrijke cellen zullen bevatten, geheel of gedeeltelijk, voltooid binnen een half uur. Als eerste stap wordt het overzicht met lage resolutie van het hele lint vastgelegd en het overzicht helpt om de secties weg te laten die voorbereidingsartefacten tonen (bijvoorbeeld plooien, vuil). Daarna kan de acquisitie handmatig of automatisch rechtstreeks op geselecteerde delen van de sectie of een hele sectie worden uitgevoerd, met behulp van enkele of mozaïekafbeeldingen, gevolgd door stiksels(figuur 4E). Daarna kunnen afbeeldingen uit het geselecteerde gebied worden verkregen met behulp van parameters met een hoge resolutie. Mitochondriën, kernen en microvilli kunnen bijvoorbeeld profiteren van een dergelijke statistisch verbeterde methode(figuur 4Ei-iii). Analyse van meerdere kleine, dun verdeelde structuren met een bereik van 500-1.000 nm (aanvullende film 1)In dit scenario kan de ROI niet eenvoudig worden geïdentificeerd in een overzichtsscan met lage vergroting en zijn afbeeldingen met een hoge resolutie nodig. In conventionele TEM-monsters is het vervelende in- en uitzoomen van de sectie noodzakelijk totdat de vereiste functie is gevonden. Vaak is het in beeld brengen van meerdere onafhankelijke locaties in meerdere monsters statistisch relevanter dan het genereren van een enkel groot volume. In dergelijke gevallen groeit de complexiteit van handmatige acquisitie exponentieel. Hoewel verschillende TEM-oplossingen de automatische acquisitie of de screening van meerdere rasters mogelijk maken, maken de grootte van het raster en seriële sectie-uitdagingen de aanpak vaak incompatibel voor veel monsters. Voor vergelijkbare gevallen genereren we een volledige kaart met gemiddelde resolutie van een totale ROI in meerdere secties met een resolutie die voldoende is om de interessante structuren te identificeren. Tijdens deze laterale screeningstap is het raadzaam om meerdere secties tegelijk te springen, met als doel ten minste een deel van de structuur van belang te raken wanneer deze willekeurig wordt benaderd. Dit zal grotendeels afhangen van de totale afmetingen van de structuur: bijvoorbeeld, als de totale grootte van de structuur 500 nm is en secties 50 nm dik zijn, zullen ten minste negen opeenvolgende secties op een rij waarschijnlijk een deel van de structuur van belang bevatten. Op deze manier zal het overslaan van 6-7 secties efficiënt zijn voor het vinden van veel verschillende soorten structuren in meerdere gebieden. Automatische acquisitie van de opgeloste mozaïekkaarten van geselecteerde secties maakt een zorgvuldige screening van deze secties na hun verwerving mogelijk. Zodra een dergelijke kaart met hoge resolutie is verkregen, kunnen verschillende ROI’s worden bijgesneden of worden gebruikt om extra lokale beeldvormingsgebieden op ROI’s te definiëren(Aanvullende film 1). Golgi, centriolen, juncties, microtubuli, verschillende soorten blaasjes zijn goede voorbeelden van de structuren die baat kunnen hebben bij dit scenario(Aanvullende film 1). Analyse van schaars verdeelde grote ROI’s in grote steekproeven (figuren 4F-4H)Dit scenario omvat zeldzame gebeurtenissen, die vaak worden beschreven als “een speld in een hooiberg” waarin het probleem niet ligt in ROI-identificatie, maar in de lokalisatie ervan. Voor veel monsters is correlatieve benadering geen geldige optie, maar vaak heeft de ROI een onthullende ultrastructuur en kan, wanneer gelokaliseerd, met hoge betrouwbaarheid worden geïdentificeerd. Voor deze monsters is het essentieel om multilevel acquisitie toe te passen, te beginnen met de vooraf gescreende monsters met tientallen tot honderden secties met een gemiddelde resolutie. In de software die hier wordt gebruikt, zijn er twee verschillende strategieën voor het verkrijgen van afbeeldingensets van meerdere secties: het opnemen van de voorbeeldafbeeldingen met een hogere resolutie of het verkrijgen van een arraytegelset met geschikte instellingen(Figuur 4F). Verschillende gespecialiseerde celtypen inde Drosophila-darm zijn willekeurig verdeeld (bijv. Stam, entero-endocriene cellen) en dunne secties in willekeurige oriëntatie. Toch kunnen ze visueel worden onderscheiden na het screenen van de beelden die zijn verkregen met behulp van parameters met hoge resolutie, hetzij uit afzonderlijke secties of als een verzameling seriële afbeeldingen(Figuur 4G). Na de uitlijning kunnen de stacks worden gerenderd met behulp van verschillende softwareoplossingen(Figuur 4H,Aanvullende Film 2). Scenario 1: Intestinale organoïden (Figuur 5A)Organoïden zijn hard op weg een van de meest geavanceerde hulpmiddelen van de moderne levenswetenschappen te worden. Dit bijna fysiologische 3D-stamcel-afgeleide orgaanmodel maakt een nauwkeurige studie mogelijk van een reeks in vivo biologische processen, waaronder weefselvernieuwing, respons op geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. Onlangs geïntroduceerde mini-darmbuizen34 openen een nieuwe generatie organoïde technologie, die sterk lijkt op in vivo weefselfysiologie, celtypesamenstelling en homeostase, waardoor brede perspectieven mogelijk zijn voor ziektemodellering, gastheer-microbe-interactie en medicijnontdekking. Wanneer echter ultrastructurele karakterisering vereist is, kan de lokalisatie van verschillende celtypen in dergelijk groot weefsel met behulp van willekeurige monsters een uitdaging zijn. Ook bij variabele “infectie” -testen is het cruciaal om ervoor te zorgen dat de analyse verschillende ontwikkelingsstadia onthult die het weefsel beïnvloeden. Voor dergelijke studies staat statistisch significante dekking van de steekproef centraal, maar moeilijk te bereiken met behulp van de traditionele TEM on-grid benadering. AT-scenario 1 is in dergelijke gevallen gunstig: veel opeenvolgende secties kunnen op een wafer worden gegenereerd (figuur 5Aii) en worden gescreend met behulp van parameters met een lage resolutie om de algemene interessegebieden te lokaliseren (Figuur 5Aiii; pijlen). Deze gebieden kunnen worden gericht voor verdere analyse met behulp van geavanceerde acquisitieparameters (figuren 5Aiv en figuur 5Av). Wanneer een relevante structuur wordt gedetecteerd (meestal een cluster van 5-10 secties eenmaal in elke 100-300 secties), is het gemakkelijk om zich te concentreren op elk van de interessante structuren en handmatig afzonderlijke afbeeldingen te verkrijgen of de automatiseringsfuncties te gebruiken om beeldvolumes over meerdere secties te verkrijgen. Scenario 2: Drosophila pop notum ( Figuur5B)Het bestuderen van celdeling en de mechanismen die de progressie door de celcyclus regelen, is cruciaal voor het begrijpen van zowel standaard als veranderde processen in meercellige organismen. Informatie die bestaat is vaak afkomstig van eencellige systemen; deze oplossing mist echter de kritische context van de 3D-interacties tussen de cellen in een weefsel. Een eencellige monolaag van het notum, de zich ontwikkelende rug van de Drosophila-larve, is een perfect model voor de interactie tussen de epitheelcellen in het algemeen en celdeling in het bijzonder35. Het is een gevestigd model voor moleculaire en cellulaire interacties studies met behulp van de combinatie van de gegevens die beschikbaar zijn door fluorescerende microscopie en genetische manipulaties. Abscissie, de laatste stap van celdeling, verzekert de uiteindelijke scheiding tussen twee delende cellen, en het karakteriseren van de structurele veranderingen die optreden tijdens abscissie is essentieel voor ons begrip van mitose. Mitotische delingen in het notum zijn echter niet gemakkelijk te lokaliseren op ultrastructureel niveau: de cellen zijn relatief groot, vergeleken met de abscissiezone (figuur 5B). De verhouding tussen de totale grootte van de abscissiezone en het oppervlak van de te bedekken sectie is groot(figuur 5Bi). Hoewel het mogelijk is om de abscissiezone te lokaliseren met behulp van de TEM- of SBF-SEM-methoden36,is de taak bewerkelijk. Met dit scenario kunnen de automatische overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie van de sprongen van 20-40 secties worden gebruikt om de delende cellen te lokaliseren (Figuur 5Bii). Wanneer dergelijke cellen worden geïdentificeerd, dienen de secties als anker voor nader onderzoek van de secties in de omgeving, en talrijke delende cellen kunnen worden gevonden en geselecteerd voor verdere analyse. Op deze manier kan de abscissiezone in zijn geheel worden gelokaliseerd en in beeld worden gebracht(figuur 5Biii). Afhankelijk van de vraag kunnen enkele afbeeldingen met een hoge resolutie of 3-7 beeldsequenties worden verzameld om de diepte van de structuur te dekken(figuur 5Biv). Scenario 3: Muizen tanycyte neuronen (Figuur 5C)De muis biedt een goed ingeburgerd model voor hersenontwikkeling en is goed gedocumenteerd op verschillende niveaus, waaronder door EM. Hoewel verschillende geautomatiseerde seriële blok-gezichtmethoden op grote schaal zijn gebruikt om hersenweefsel te bestuderen, zijn er gevallen waarin AT beter is aangepast om de nodige gegevens te verzamelen. De hypothalamus is een gevestigde neurowetenschappelijke model, een deel van de hersenen dat meerdere neuronale typen functies bevat. Hypothalamische tanycyten vertegenwoordigen een bepaalde subset van ependymogliale cellen langs de onderkant van de derde ventrikel, met ongewoon lange processen (tot 300 μm) en grote eindvoeten (~ 5 μm)37. Dit maakt ze onhandig voor de analyse door TEM- of FIB-methoden. De taak wordt verder gecompliceerd wanneer verschillende onafhankelijke tanycyten moeten worden gelokaliseerd en geanalyseerd. Een van de benaderingen om deze taak te vergemakkelijken kan semi-correlatieve targeting zijn, waarbij de fluorescentiekaart wordt verkregen uit de fluorescerend gelabelde monsters voordat deze worden gefixeerd en ingebed voor EM. De sectie wordt uitgevoerd op het gebied dat is vastgelegd door de positionele informatie van het fluorescentiemonster en de platte ingebedde plastic replica te combineren. Daarna kan het AT-scenario 3 worden gebruikt: de overzichtsmozaïekafbeeldingen op hoog niveau worden gegenereerd om de gebieden met tanycyte-eindfeetclusters te onthullen. Vervolgens worden automatiseringsfuncties in de software gebruikt om de acquisitie van reeksen van de afbeeldingen uit een of meer gebieden in een enkele afbeeldings- of tegelmodus in te stellen. Deze afbeeldingen kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd, als uitgelijnde stapels of daarna worden gerenderd. De kracht van de AT-methode maakt de relatief moeiteloze “upgrade” van gegevens van 2D naar 3D mogelijk: de kaarten zijn beschikbaar vanaf de primaire acquisitie en de volumes kunnen worden verkregen uit het geselecteerde gebied en de omgeving. De resulterende stack kan worden uitgelijnd en vervolgens worden gerenderd. Het is essentieel om vooraf te bepalen welke resolutie en beeldkwaliteit nodig zijn om ROI’s te vinden. Beeldvorming moet het mogelijk maken om de ROI’s te herkennen, maar niet boven deze waarde, omdat de acquisitietijd proportioneel schaalt met de verblijftijd van de pixels en het omgekeerde kwadraat van de pixelgrootte. Figuur 1: Uitdagingen van EM-monstervoorbereiding en volumeverwerving. (A) Het verlies van fluorescentie en krimp treedt op als gevolg van een hoge concentratie zware metalen en uitdroging tijdens de monstervoorbereiding. i) Een schematische tekening van een monster dat is waargenomen onder LM (ii) hetzelfde monster dat is voorbereid op EM, dat volledig ondoorzichtig wordt en ongeveer 10% van zijn volume verliest. (B)Monsterinbedding wordt meestal gedaan met behulp van epoxy- of acrylharsen. Traditionele blokken (i) kunnen met succes worden gebruikt voor homogene monsters die geen specifieke oriëntatie vereisen. Platte blokken (ii) zijn nuttig wanneer het essentieel is om onder de microscoop een nauwkeurig gebied te richten en te oriënteren dat gericht is op sectie, bijvoorbeeld in niet-homogene monsters of correlatieve microscopieprocedures. (C) Van het gehele monstervolume wordt slechts een beperkte fractie weergegeven op een enkele sectie van 50 nm, wat een 2D-beeld van een 3D-monster oplevert, vaak in een onbekende oriëntatie. (D) Om het probleem van het registreren van te grote volumes versus precieze targeting te illustreren, kozen we drie concentrische kubussen met de vlakken van 1000, 500 en 50 μm zijn georganiseerd om een hypothetisch monster van 1000 x 500 x 500 μm (donker kastanjebruin) op te nemen. Als dergelijke hypothetische monsterkubussen grondig worden doorsneden met plakjes van 50 nm, om het volledige volume te dekken, zijn er in totaal 20.000, 10.000 en 1.000 plakjes nodig, en 800 tb, 100 tb en 100 gb(beeldresolutie 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8 bits gegevens). Dit toont het belang aan van het plannen van de verwerving van EM-gegevens alleen om het minimaal noodzakelijke volume te verkrijgen. (E) Het bedekken van een groot monsteroppervlak in hoge resolutie levert een probleem op dat vergelijkbaar is met dat van grote volumes. Het betegelen van meerdere afbeeldingen met een hoge resolutie in één is een nuttige oplossing voor een dergelijk probleem. Om een oppervlak van 1 mm x 1 mm te bedekken met behulp van het 2024 x 1048-frame in 10.000x vergroting, is echter een groot aantal tegels nodig, wat een uitdaging kan worden om te naaien. Verder, als secties variabel worden gecomprimeerd of vervormd tijdens het snijden, worden de resulterende gegevensstapels bijna onmogelijk uit te lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: De workflow voor het direct genereren van de arrays van secties op grote ondersteuning. (A) Voor strak trimmen met behulp van het trimgereedschap worden blokken vastgezet in de microtome-houder. Deze stap helpt om parallelle zijden van een blok te garanderen en vermindert ook lege hars rond het monster. (B) Een aangepast mes voor AT-secties acquisities. Een grote boot vergemakkelijkt de overdracht van de secties en hun manipulatie tijdens het sectieen van het monster en de overdracht op de ondersteuning. Een groot bassin maakt de manipulatie van de secties mogelijk; het afvoersysteem beperkt de beweging van de linten tijdens de afwateringsstap, de vlakke bodem maakt het geleidelijk drogen van de ondersteuning betrouwbaar. (C) Het mes, klaar om te worden doorsneden met een gloeiende wafer geplaatst op de bodem van het bassin en water water geëgaliseerd tot aan de randen. De constructie van het mes houdt de naald ingebed, zonder de ondersteuning te verstoren. (D) Array generatie, bovenaanzicht op de microtoom sectie gebied. (i) De eerste secties zijn meestal gemakkelijk te verkrijgen omdat ze aan elkaar kleven en een regelmatig lint vormen. (ii) Wanneer er meer secties aan het lint worden toegevoegd en het langer wordt, verliest het lint zijn stabiliteit en buigt het vaak. Het is cruciaal om de sequentietracks in volgorde georganiseerd te houden ter voorbereiding op de stap voor het verwerven van afbeeldingen. (iii) Wanneer een lint van secties de gewenste lengte bereikt, wordt het zorgvuldig van de mesrand losgemaakt met behulp van een wimper. iv) water uit het bassin wordt afgevoerd; de wafer blijft binnen totdat deze volledig aan de lucht droog is. Deze stap is essentieel, omdat het helpt om de secties recht te trekken en de vorming van de microplooien te voorkomen. De wafer wordt minstens 30 minuten in de oven op 60°C geplaatst om de secties op de steun te bevestigen. (E) Voorbeeldwafers met de overgedragen secties. Hoewel het handig is om rechte en nauwkeurige linten te verkrijgen, voorkomen echte monsters in de meeste gevallen de vorming van dergelijke ideale linten. Niettemin zijn zelfs “slordige” linten zeer informatief voor het grote aantal gevallen, en het belang van het “nette” lint zal afhangen van een onderzoeksstrategie waarvoor de secties worden verzameld. Schaalbalk 1 cm. (F) Voorbeeld sleufrasters met de seriële secties. Zelfs wanneer veel secties op één raster worden verzameld, is het nog steeds een kleine fractie van wat op een enkele wafer kan worden verzameld. De vaardigheid die nodig was om de overdracht van de secties op een raster (met name slotraster) onder de knie te krijgen, vormde een belangrijk knelpunt voor het beheersen van de monstervoorbereiding van elektronenmicroscopie. Schaalbalk 500 μm. (G) Het maakt niet uit welke sectieverzamelingsmethode werd gebruikt, de sterke punten van de AT-benadering zijn het relatieve gemak van het genereren van sequentiële secties, vergeleken met de on-grid verzameling. Als een monsterblok van 1000 μm x 500 μm wordt overwogen, is het geen probleem om ongeveer 100 secties op een wafer van 2 cm x 4 cm (i) te plaatsen. Secties van dezelfde grootte op een sleufraster passen maximaal slechts drie secties /raster (ii). We bieden een geschaalde afbeelding om te laten zien hoeveel rasters nodig kunnen zijn om hetzelfde aantal secties te dekken, zonder de moeilijkheid van het verzamelen van seriële secties op het raster te vermelden. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Kritieke stappen van de arraytomografieworkflow. Schema van de workflow voor de onbeheerde acquisitie van afbeeldingsstapels met hoge resolutie. Alle voorbereidende stappen zijn geautomatiseerd (groene tandwielsymbolen) en vereisen geen acties die handmatig moeten worden uitgevoerd, sectie voor sectie. Beeldstapels kunnen worden uitgelijnd in elke beeldanalysesoftware die in staat is tot automatische rigide of affiene uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Drie acquisitiescenario’s met Drosophila volwassen darm als demonstratiemodel. (A) tekening van een ontleed Drosophila midgut, met drie belangrijke regio’s aangeduid door verschillende kleuren: voorste, middelste en achterste. (B) Getrimd vlak blok waarin een darm is georiënteerd voor dwarsdoorsnede. Merk op dat de lege hoeveelheid hars zorgvuldig wordt gebalanceerd rond het weefsel dat het interessegebied bevat (witte rechthoek). (C) Dwarse seriële secties drijven op het wateroppervlak in het bassin van het AT-mes. Alle beelden werden verkregen in secundaire elektronen SEM-modus met behulp van de spiegeldetector met het omgekeerde contrast. (D) Gestikt mozaïekbeeld van dwarse seriële secties op een wafer. Schaalbalk is 1000 μm. (E) Doorsnede door Drosophila darm. Schaalbalk 20 μm. De afbeelding is een gestikt mozaïek van 7 x 7 mid-range afbeeldingen. Inzetstukken – hogere vergrotings- en resolutiebeelden van de specifieke interessegebieden: (ii) kern, (iii) borstelrand en (i) mitochondriën. Schaalbalk 5 μm voor iedereen. (F) Een mid-range afbeelding van een dwarsdoorsnede door de darm die zich richt op de locatie van ontwikkelende cellen (vierkant). Schaalbalk is 20 μm. (G) De beoogde array van seriële secties verzameld op basis van het gebied gelokaliseerd tijdens de analyse van de sectie aanwezig in paneel F. Schaalbalk is 10 μm. (H) Het 3D-model wordt gerenderd op basis van de 50 secties stapelvolgorde verkregen uit de beoogde seriële acquisitie in paneel G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Case studies voor de AT toepassingsscenario’s. (A) Lokalisatie van verschillende celstructuren in de darmorganoïde. i) Ingebouwde siliciummicrochip. Schaalbalk = 200 μm. (ii) Een gestikt mozaïekbeeld van 127 doorsneden door het centrale deel van de chip. Schaalbalk = 1500 μm (iii) Vier lage resolutie beelden van een volledige dwarsdoorsnede door het deel van de darmorganoïde. Pijlen wijzen naar de potentiële bezienswaardigheid. Schaalbalk is 20 μm. (iv) Verschillende ROIs, gericht op micrografieën met lage resolutie geselecteerd voor verdere analyse. Schaalbalk = 10 μm. (v) Afbeelding met hoge resolutie van de geïnfecteerde cel van belang. Analyse van dezelfde regio in de aangrenzende secties kan indien nodig gerichte 3D-informatie opleveren. Schaalbalk = 5 μm. (B) Lokalisatie van het middenlichaam in Drosophila melanogaster popnotum. (i) Een schematische weergave van een ontleedde Drosophila pop. Notum blootgesteld voor de dissectie (beige) na het verwijderen van het deel van de beschermende cuticula (bruin). De zwarte lijn geeft de doorsnede aan (ii) Een doorsnede door het gebied in het diagram. De afbeelding combineert 3×7 opeenvolgend genomen SEM-afbeeldingen met hoge resolutie die op één mozaïekpaneel zijn gestikt. De zwarte rechthoek scheidt het gebied af dat een delingcel bevat. Schaalbalk is 15 μm. (iii) Een ingezoomde afbeelding op de delingcel van paneel ii. Bij deze vergroting en resolutie is het middenlichaam duidelijk (witte pijlen). Het hele gedeelte wordt geanalyseerd om de delende cellen te vinden. Springen tussen verschillende linten van secties in intervallen van 20-30 secties tijdens de laterale screeningstap maakt het mogelijk om talloze delende celparen te lokaliseren. Schaalbalk is 5 μm (iv) wanneer een delende cel is gelokaliseerd, opeenvolgende beelden van het middenlichaam verzameld uit vier secties rond het middenlichaam begrensd door geel vierkant in het paneel (iii). Schaalbalk is 1 μm. (C) Tanycytes endfeet lokalisatie in muis hypothalamus. i) Fluorescentiebeeld van een tribratoomschijfje. Tanycyten drukken tdTomato fluorescerend eiwit (rood) uit. Een witte rechthoek bakent het interessegebied af. Schaalbalk 500 μm. (ii) Dezelfde vibratome-sectie die is voorbereid voor EM zal zorgvuldig worden bijgesneden rond het interessegebied – op basis van de indirecte correlatie van fluorescerende informatie van paneel (i). De gestippelde witte lijn vertegenwoordigt het gebied van ultradunne secties. De schaalbalk is 50 μm voor beide panelen. iii) Doorsnede door de vibratome-plak in het interessegebied. SEM mozaïek afbeelding is samengesteld uit 75 gestikte afbeeldingen. Verschillende secties zijn het doelwit van laterale screening en afgebeeld met vergelijkbare parameters. De secties worden “offline” geanalyseerd om de ROI te vinden – de tanycyte endfeet. De zwarte rechthoek vertegenwoordigt het gebied dat de tanycyte-eindvoet bevat. Deze sectie zal dienen als een anker voor verdere analyse. Schaalbalk is 15 μm. (iv) Hoge resolutie, hoge vergrotingsbeeld van tanycyteneindvoet rond een bloedvat. Na de eerste lokalisatie van de ROI op één sectie, wordt de z-reeks verzameld van de aangrenzende secties stroomopwaarts naar de ankersectie (paneel iii). Schaalbalk 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Problemen tijdens ultramicrotomie, sectieverzameling en sectieopslag kunnen leiden tot artefacten. (A) Hersenmonstersecties op een wafer. Het grootste deel van de lege hars maakte zich los van het weefsel en vouwde zich op zichzelf (sepia). Onderbroken zwart vak duidt een gebied aan dat wordt gebruikt om de hele sectie te bevatten. Schaalbalk 500 μm. (B) Een kleine, lokale vouw op het oppervlak van een 50 nm dikke zebravissectie. Schaalbalk 1 μm. (C) Mesmarkering op het oppervlak van een 70nm muishersensectie. Schaalbalk 5 μm. (D) Het haar (sterretje) op het oppervlak van de wafer dat gedeeltelijk een zebravisspiergedeelte bedekt. In geel wordt het weefsel gericht op de analyse. In roze diende een cel als referentie voor de grootte van het getroffen gebied. Schaalbalk 50 μm. (E) Zebravis notochord met rimpels rechtsonder (zwarte pijlen), waar dicht neuraal weefsel (beschaduwd in blauw) grenst aan zachter spierweefsel en lege hars (zwarte pijlen). Schaalbalk 10 μm. (F) Volumesegmentatie van een stapel van 50 afbeeldingen zoals in E, waaruit blijkt dat dit gebied rimpels vertoonde in de meeste secties. Onderbroken veelhoek schetst het gebied dat wordt weergegeven in de G. Schaalbalk 10 μm. (G) XY-weergave van dezelfde volumesegmentatie als in F, waarbij de rimpels worden weergegeven als korte zwarte lijnen in de rechterhelft van het blok. Merk op dat de uitlijning van de stapel in de resterende delen van het weefsel niet wordt beïnvloed door de rimpels. Schaalbalk 5 μm. (H) XZ-projectie van hetzelfde gebied als in G, met de rimpels in alle 50 secties. Schaalbalk 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende film 1: Een montagebeeld met hoge resolutie van een doorsnede door Drosophila anterieur midgut. Mozaïekafbeelding van een omgekeerde SE-MD SEM-afbeelding. 352 afzonderlijke beeldtegels werden automatisch verkregen met een resolutie van 5 nm en gestikt om de volledige doorsnede te presenteren. Het is mogelijk om in te zoomen voor meer details en een uitgebreide dekking van de gegevens te krijgen, met behulp van dezelfde afbeelding. Tight junctions, microtubuli, verschillende soorten blaasjes kunnen zijn bij het inzoomen. Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om dit filmpje te downloaden. Aanvullende film 2: Drosophila darmcellen rendering. Vijftig uitgelijnde mozaïekbeelden van de secties op het gebied van delende darmcellen. IMOD-weergave van de celranden (blauw, turkoois en oranje) en kernen (wit). Klik hier om dit filmpje te downloaden. Aanvullende materialen. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Discussion

Elektronenmicroscopie geeft inzicht in de ultrastructuur van de cellen en organismen, waarvoor het vaak wenselijk is om interessante structuren in hun 3-dimensionale context in beeld te brengen. Ondanks talloze EM-tactieken voor ultrastructurele analyse, is er nog steeds geen “gouden standaard” -oplossing. De belangrijkste reden is de grote verscheidenheid aan monsters, veel biologische vragen, die vaak een aanpak op maat vereisen. De voorgestelde AT-workflow is ontworpen om de tijd die nodig is voor monsterverwerking, gegevensverzameling, evaluatie en opslag te minimaliseren. Bovendien biedt het aangepaste mes een nuttig hulpmiddel om de acquisitie van arrays te vereenvoudigen. De compacte lay-out van secties op wafers is handig, zowel voor de observatie als de daaropvolgende opslag van de monsters. Deze opstelling maakt “Laterale screening” van monsters mogelijk door horizontaal van lint naar lint te gaan en slechts één sectie op elk te scannen, waardoor de tijd die nodig is om een ROI te lokaliseren aanzienlijk wordt verkort. Voorgestelde scenario’s voor gegevensverzameling vergemakkelijken het richten van kleine en willekeurig verspreide gebieden. Eenmaal gevonden, beperkt AT / SEM beeldvorming met hoge resolutie precies tot het volume van interesse, of het nu handmatig of met behulp van een automatische functie wordt uitgevoerd. AT voor beperkte volumes kan handmatig worden voltooid, waarbij de operator één voor één door het monster navigeert en beeldgebieden definieert. De geautomatiseerde module van de software biedt een flexibele beeldacquisitiestrategie voor beeldvorming van kleine gebieden op grote secties. De automatisering in deze software maakt het mogelijk om grote beelden met een hoge resolutie op honderden secties op te nemen, waardoor vergelijkbare volumes als SBFI worden bereikt. Het opnemen van overzichtsbeelden van alle secties vereenvoudigt de ROI-lokalisatie en vermindert de tijd die aan de microscoop wordt doorgebracht. Aangezien de secties niet worden geschaad tijdens het opnemen van overzichten en previews met een hogere resolutie, staat AT/SEM toe dat het monster wordt hergebruikt om verdere gegevens van andere ROI’s of met een hogere resolutie te verzamelen.

Beeldacquisitietijd is een van de belangrijkste (en duurste) aspecten van 3D EM en moet daarom worden overwogen in het experimentontwerp. Hoewel het niet verwonderlijk is dat het fotograferen van grote gebieden langer duurt dan het afbeelden van kleine gebieden, is het gemakkelijk om de impact te onderschatten: afhankelijk van de geselecteerde beeldvormingsparameters kan de acquisitietijd op elke sectie variëren van seconden tot uren. Kritieke beeldvormingsparameters omvatten de grootte van het gezichtsveld, de resolutie en de verblijftijd. Uitgaande van een doelresolutie van 10nm per pixel en 1 μs verblijftijd, duurt het fotograferen van een veld van 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm of 500 μm x500 μm 4 seconden, 100 seconden of 2.500 s om op te nemen. We kunnen deze beeldvormingstijden per sectie vermenigvuldigen met het aantal secties om de tijd te schatten die nodig is voor de volledige beeldvormingstaak. Lange beeldvormingstijden per sectie kunnen acceptabel zijn als het aantal secties klein is of als de tijd van het microscoopgereedschap geen probleem is.

Het is echter in de meeste gevallen noodzakelijk om de opnametijd te beperken tot een nachttaak of een weekendtaak. Een even kritisch aspect van 3D EM dat moet worden overwogen, is de hoeveelheid en structuur van de resulterende beeldgegevens. Het opnemen van de bovengenoemde beeldvelden in 100 secties genereert respectievelijk 400 mb, 10 gb of 250 GB aan beeldgegevens; de beelden van 500 μm x 500 μm vormen het bijkomende probleem dat ze elk groter zijn dan 2 gb. Veel van de softwareprogramma’s die worden gebruikt voor gegevensevaluatie kunnen geen afbeeldingen van deze grootte openen.

Om de beeldtijd te verkorten, is het belangrijk om pixelverblijftijd te kiezen om te voldoen aan de vereisten voor signaal-ruisverhouding voor de daaropvolgende gegevensevaluatie (bijv. Reconstructie, tracering) en de opnames te beperken tot gedefinieerde ROI’s. De AT-uitbreiding van de software vergemakkelijkt beeldacquisitie in kleine gebieden in seriële secties. De software ondersteunt handmatige en automatische workflows en vele semi-automatische varianten: beeldgebieden kunnen handmatig worden gepositioneerd en op elke sectie worden gericht, of de gebruiker kan de automatische sectiezoeker en positie-uitlijningsfuncties gebruiken. Afhankelijk van het automatiseringsniveau dat wordt gekozen en ondersteund door het voorbeeldtype of de beelddoelen, kan de tijd die nodig is voor het instellen van beeldacquisitie in honderden secties een hele werkdag (handmatig gedaan) of slechts enkele minuten duren. In principe maakt Array Tomography het uitdagender dan andere 3D EM-methoden om kleine ROI’s te verwerven; onnauwkeurige plaatsing van regio’s op opeenvolgende secties moet worden gecompenseerd door grotere gebieden te verwerven. Als de ROI bijvoorbeeld 20 μm x 20 μm groot is en de sectie-tot-sectie positievariabiliteit van beeldvormingsvelden 10μm is, moet men 40 μm x 40 μm afbeeldingen verkrijgen om er zeker van te zijn dat de ROI volledig wordt vastgelegd in elke afbeelding, op elke sectie. Real-world beeldpositievariabiliteit varieert van 100 μm tot <10 μm, afhankelijk van de beschikbaarheid of kwaliteit van softwarefuncties voor positie-uitlijning of het geduld van de gebruiker. Met deze software kan 10 μm worden bereikt zonder al te veel handmatige tussenkomst in de meeste monsters.

Zoals elke techniek heeft de AT verschillende zwakke punten die succesvolle gegevensverzameling kunnen beïnvloeden, en veel zijn vergelijkbaar met andere op secties gebaseerde methoden. Gebrek aan homogene verdeling van lege hars versus weefsel kan resulteren in gebogen of gebroken arrays. In extreme gevallen kunnen secties loskomen van de ondersteuning(figuur 6A). Variabele compressie of uitrekking tijdens het snijproces kan plooien creëren die het monster in variabele gebieden op volgende secties kunnen verstoren(figuur 6B). Mesmarkeringen kunnen op het oppervlak van de verzamelde secties verschijnen met behulp van een beschadigd mes(figuur 6C). Verschillen in sectiecondities kunnen incidentele sectiecompressie en dikteverschillen veroorzaken. Stof- of vuildeeltjes kunnen op een sectie terechtkomen en de interessezone gedeeltelijk verduisteren(figuur 6D). Beeldacquisitie kan mislukken als gevolg van onvolmaakte autocontrast, autofocus en auto-stigmatiseringsfuncties. De positionering van automatisch gemaakte beeldgebieden kan variabel zijn en kan de ROI in alle secties niet vastleggen.

Verschillende problemen kunnen zich voordoen in het stadium van stiksel en uitlijning. Het automatisch naaien van mozaïektegels kan bijvoorbeeld mislukken vanwege de grote lege ruimte in het monster. Door een drastische verandering in vorm in 3D kunnen beeldstapels een uitdaging zijn om te registreren. Speciaal ontwikkelde programma’s (bijv. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB of MAPS-AT) kunnen semi-automatische uitlijning^{32,38,39,40 vergemakkelijken.} Meer uitdagende secties kunnen handmatig worden uitgelijnd met behulp van fotobewerkingssoftware. Helaas zijn sommige datasets mogelijk niet correct uit te lijnen.

Grote monsters zijn een uitdaging voor TEM seriële secties die op roosters passen; aan de andere kant rechtvaardigen veel projecten geen lange automatische acquisitie met behulp van FIB/SEM of SBF-SEM. De AT is een eenvoudig alternatief voor een vervelende seriële sectie TEM waar het verzamelen en manipuleren van seriële secties op een wafer eenvoudiger is dan met de slotrasters. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om het verzamelen van de arrays te vergemakkelijken en we delen onze methode om de bestaande toolkit uit te breiden. In gevallen waar de identificatie van de ROI een uitdaging is, biedt AT-SEM een fundamenteel voordeel, met de efficiënte screening van de monsters waarbij organelschaalresolutie over 50 tot 500 secties vereist is. Voor grotere volumes kunnen de automatische AT-strategieën voor verzameling efficiënt worden verzameld als er meer secties nodig zijn. AT-monsters kunnen meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, waardoor gebieden met een hoge resolutie op basis van eerder verkregen overzichtsbeelden doelgericht kunnen worden afgebeeld. Wij zijn van mening dat de gerichte analyse en verminderde oversampling door AT / SEM die hier wordt voorgesteld, de arbeids- en gegevensopslagvereisten vermindert. Uiteindelijk kunnen bibliotheken van secties worden verzameld en onderhouden voor later hergebruik en raadpleging. Voor volume-acquisitie bieden FIB- of SBF-SEM-benaderingen een uitstekende oplossing wanneer de ROI gemakkelijk te identificeren is op het blokvlak of als grote 3D-volumes nodig zijn voor de analyse. FIB/SBF-SEM zijn echter minder efficiënt wanneer de stackafbeelding met hoge resolutie op een gerichte manier moet worden verzameld uit een gedefinieerde ROI. Kortom, de voorgestelde methoden voor het screenen van AT-monsters en het gebruik van overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie maken het mogelijk om beeldacquisitie te beperken tot de relevante delen van de sectie-array. Nauwkeurig richten van beeldregio’s versnelt de time-to-data en vereenvoudigt de gegevensevaluatie.

Kortom, hoewel het concept van AT/SEM niet nieuw is, is het gebruik ervan nog steeds niet zo wijdverspreid als de verdiensten ervan doen vermoeden. Over het algemeen biedt het een aanvullende procedure voor andere bestaande EM-methoden. AT/SEM is compatibel met het breedste scala aan monstervoorbereidingsprotocollen en beeldvormingsworkflows en kan als begeleidende techniek op elke FIB/SEM- of SBF-SEM-microscoop worden uitgevoerd. In dit artikel hebben we ons geconcentreerd op AT voor het vastleggen van ultrastructurele gegevens van monsters die minder snel met succes worden aangepakt door andere methoden. We hopen dat de beschreven procedure voor het gemakkelijk verzamelen van secties en aanzienlijk geautomatiseerde acquisitiestrategieën zal helpen bij de eerste pogingen voor degenen die de methode nog nooit zijn tegengekomen en zal helpen om het te perfectioneren voor degenen die al enige ervaring hebben.

Materials

Cutting
AT sectioning knife	Diatome	DUATS3530	Diatome Jumbo knife
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90	Diatome trimming 20° Glass knife
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C
Silicon wafer	Ted Pella	16015	Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side
Ultramicrotome	Leica UC6		Alternative: Leica UC7
Wafer cleaving kit	EMS	7642	EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652
Image acquisition
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography	Thermo Fisher Scientific	1135932	Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.
Image analysis
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (See text for refferences)