Vi beskriver forberedelsen af bånd af serielle sektioner og deres samling på stor overførsel støtte til brug som Array Tomography prøver, sammen med automatiserede billedbehandling procedurer i en scanning elektron mikroskop. Protokollen tillader screening, hentning og målrettet billeddannelse af lokale, sjældne hændelser og erhvervelse af store datamængder.
Elektronmikroskopi påføres i biologi og medicin til billeddannelse af cellulære og strukturelle detaljer ved nanometeropløsning. Historisk set har Transmission Electron Microscopy (TEM) givet indsigt i celle ultrastruktur, men i det seneste årti har udviklingen af moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) ændret måden at se inde i cellerne. Selv om opløsningen af TEM er overlegen, når protein-niveau strukturelle detaljer er nødvendige, SEM-opløsning er tilstrækkelig til de fleste af de organelle-niveau cellebiologi-relaterede spørgsmål. Udviklingen inden for teknologi muliggjorde automatiske volumenopsamlingsløsninger som Serial block-face imaging (SBF-SEM) og Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Ikke desto mindre forbliver disse metoder den dag i dag ineffektive, når identifikation og navigation til interesseområder er afgørende. Uden midler til præcis lokalisering af målområder før billeddannelse skal operatørerne erhverve meget flere data, end de har brug for (i SBF-SEM), eller endnu værre forberede mange gitre og afbilde dem alle (i TEM). Vi foreslår strategien med “lateral screening” ved hjælp af Array Tomography i SEM, som letter lokaliseringen af interesseområder, efterfulgt af automatiseret billeddannelse af den relevante brøkdel af det samlede prøvevolumen. Arraytomografiprøver bevares under billeddannelse, og de kan arrangeres i sektionsbiblioteker, der er klar til gentagen billedbehandling. Flere eksempler er vist, hvor lateral screening gør det muligt for os at analysere strukturelle detaljer, der er utroligt udfordrende at få adgang til med enhver anden metode.
På trods af betydningen af EM-relaterede teknikker holder den indsats, der kræves for at mestre dem, hele området begrænset til et lille antal specialister. Et væsentligt problem er identifikation og hentning af en region af interesse (ROI) i prøverne bevaret for EM. Udseendet af den samme prøve adskiller sig betydeligt, når den analyseres ved optisk mikroskopi og efter behandling til EM-observation. Ændringerne for kemisk forberedte prøver omfatter anisotropisk prøve krympning efter dehydrering trin (~ 10% i hver dimension) og tab af fluorescens ved brug af osmium i fiksering og farvning protokol (Figur 1A). For ultratynde afsnit, prøverne er indlejret i epoxy eller akryl harpikser ved hjælp af forskellige strategier (Figur 1B). For at opnå vellykkede resultater af dette præparat skal hele prøven være fraktioneret i stykker, der ikke overstiger 1 mm x 1 mm. For at opfylde standardkravene til TEM(Transmission Electron Microscopy) er denne lille del af prøven yderligere opdelt til 50-150 nm tykke skiver. De resulterende gråtonebilleder viser vævsorganisation og organellestruktur på en minutfraktion af hele prøven mere detaljeret end nogen anden mikroskopiteknik (Figur 1C). Et typisk TEM datasæt giver 2D-information, teoretisk ekstrapoleret til at forstå de processer, der naturligt forekommer i et 3D-rum i celler og væv. Figur 1D udgør udfordringen ved erhvervelse af ultrastrukturelle mængder: Hvis en terning på side 1.000 μm er opdelt ved 50 nm tykkelse, kræves der 20.000 sektioner til at dække hele volumen; for en 500 μm sidekube, vil det være 10.000 sektioner. For at dække et volumen på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan det være nødvendigt med 1.000 sektioner “kun”. At opnå dette volumen manuelt er praktisk talt umuligt og ekstremt udfordrende at udføre med automatisering. Hvis vi ud over prøvedybden skal dække hele overfladen af sådanne hypotetiske terninger, bliver dækningen af 1 μm2 overflade ved rimelig opløsning et alvorligt logistisk problem (figur 1E). Selv om det store antal sektioner for de ekstraordinære store projekter, såsom connectomics-tilgange, er afgørende for de fleste “verdslige” EM-projekter, udgør det en betydelig ulempe at generere flere sektioner, der er nødvendige for observationen.
Der er flere metoder til at erhverve 3D ultrastrukturelle oplysninger: seriel afsnit Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM), og Fokuseret Ion Beam Scanning ElektronMikroskopi (FIB-SEM). De væsentligste forskelle mellem disse metoder er sektionsstrategien , og om billedopsamlingen er koblet til sektionsgenerering1. I seriel afsnit TEM indsamles sekventielle sektioner på slotgitre, TEM-afbildninger genereres fra disse sekvenser og justeres2,3,4,5. I TEM-tomografi giver vippeserier fra 150-300 nm sektioner på et gitter, og når de kombineres med seriel sektion, en meget høj opløsning, men relativt små mængder6,7,8. AT-tilgangen bruger fysisk sektion med forskellige manuelle og halvautomatiske manerer af sektioner, der er samlet på relativt stor støtte, såsom glasovertræk, silicium wafers eller et specielt bånd. Til billedopsamling analyseres supporten i SEM, med forskellige strategier for billedopsamling er tilgængelige9,10,11,12,13,14,15 . For SBF-SEM opnås fysisk sektion ved hjælp af en minimikrotom med en diamantkniv, der er indstillet direkte inde i SEM-kammeret, med SEM-billedet genereret fra overfladen af harpiksblokken16,17,18,19. For FIB-SEM fjerner ionkilden tynde lag af prøven efterfulgt af automatisk billeddannelse af den eksponerede overflade af SEM20,21. TEM-tomografi og AT generere fysiske sektioner, som kan re-billederes, hvis det er nødvendigt, mens FSBF-SEM og FIB-SEM fjerne afsnittet efter billeddannelse. En nylig kombination af fysiske sektioner afbildet af en multi-beam SEM giver en kombination af metoder, der løser “flaskehals” spørgsmålet om hastigheden af billedet erhvervelse22. Hver af disse teknikker har revolutioneret den måde, EM-data kan indhentes og analyseres på, og hver tilgang har sine praktiske virkninger relateret til et givet forskningsspørgsmål.
I betragtning af præparatets art og omfanget af de ultrastrukturelle dimensioner er det ikke ligetil at forudsige, hvor en bestemt målstruktur er placeret i prøveblokken (Figur1D, E). En løsning til ROI lokalisering er at optage billederne fra hele blokken i den ønskede opløsning fra begyndelsen. Interessestrukturerne kan være i den erhvervede datamængde, når de er væk fra mikroskopet. Anskaffelsestid og datahåndtering i forbindelse med denne strategi er problematisk. Det er ønskeligt at reducere mængden af registrerede data, især hvis INVESTERINGSAFKAST’erne er meget mindre end vævsblokken, dvs. hvis objekter af interesse er specifikke typer celler (ikke hele organer). Forskellige korrelative lys – og elektronmikroskopiteknikker (CLEM) kan lykkes , når fluorescensen bevares og lokaliseres før eller efter tilberedningen inden for samme prøve23,24,25,26,27,28,29. Ikke desto mindre er mange cellulære strukturer genkendelige selv uden fluorescens korrelation, kun baseret på den kendte ultrastruktur. I disse tilfælde mener vi, at lateral screening Array Tomography giver en balance mellem indsatsen investeret i ROI lokalisering og den ultrastrukturelle informationskvalitet. Ved hjælp af denne strategi screenes et undersæt af sektioner på waferen med jævne mellemrum, som kan etableres baseret på INVESTERINGSAFKAST’ets størrelse og natur. Når investeringsafkast er fundet, konfigureres dataindsamlingen i en kontinuerlig række sektioner, der starter før og slutter efter ankersektionen, og indsamler de relevante oplysninger målrettet.
Vi præsenterer protokoller for AT, der forenkler og fremskynder erhvervelsen af regioner eller begivenheder af interesse i mange sektioner og giver bedre afstemt billedvolumener. Lateral screening og erhvervelse af flere skridt producerer data med meget høj opløsning i netop målrettede regioner. Den procedure, vi beskriver, løser flere udfordringer ved 3D EM-dataindsamling, som den giver: kompatibilitet med en bred vifte af prøver uden grundlæggende at ændre arbejdsgangen for prøveforberedelse; målrettet lokalisering af lokaliseringer og SEM-erhvervelser reduceret tid og kræfter under installationen; billedbehandling af områder i flere sektioner med bedre tilpasning af de resulterende diskenheder; og en glat syning og justering procedure for at kompilere forskellige billeder i en syet mosaik billede. Vi valgte at demonstrere styrken af vores metode med flere prøver fra offentliggjorte og igangværende projekter. Vi mener, at denne tilgang i høj grad kan lette generering og erhvervelse af målrettede EM-data, selv for efterforskere med begrænset EM-erfaring.
Elektronmikroskopi giver indsigt i cellernes og organismernes ultrastruktur, for hvilke det ofte er ønskeligt at afbilde strukturer af interesse i deres 3-dimensionelle kontekst. På trods af talrige EM taktik for ultrastrukturelle analyse, er der stadig ingen “guld standard” løsning. Hovedårsagen er den brede vifte af prøver, mange biologiske spørgsmål, som ofte kræver en skræddersyet tilgang. Den foreslåede AT-arbejdsproces er designet til at minimere den tid, der er nødvendig for prøvebehandling, dataindsamling, evaluering og lagring. Desuden giver den modificerede kniv et nyttigt værktøj til at forenkle array erhvervelse. Det kompakte layout af sektioner på wafers er praktisk, både til observation og efterfølgende opbevaring af prøverne. Dette arrangement muliggør “Lateral Screening” af prøver ved vandret at flytte fra bånd til bånd og scanne kun et afsnit på hver, hvilket reducerer den tid, der kræves for at lokalisere et investeringsafkast. Foreslåede scenarier for dataindsamling gør det lettere at målrette mod små og tilfældigt fordelte områder. Når at/SEM er fundet, begrænses den højopløsningsbilleddannelse præcist til mængden af interesse, uanset om den udføres manuelt eller ved hjælp af automatisk funktion. AT for begrænsede mængder kan udfyldes manuelt, hvor operatøren navigerer gennem prøven og definerer billedbehandlingsområder en efter en. Det automatiserede modul af softwaren giver en fleksibel image erhvervelse strategi for billedbehandling af små områder på store sektioner. Automatiseringen i denne software gør det muligt at optage store billeder i høj opløsning på hundredvis af sektioner og opnå lignende mængder som SBFI. Optagelse af oversigtsbilleder af alle sektioner forenkler roi-lokaliseringen og reducerer den tid, der bruges på mikroskopet. Da afsnittene ikke er skadet under registreringen af oversigter og forhåndsvisninger med højere opløsning, tillader AT/SEM at genbruge prøven til at indsamle yderligere data om andre investeringsafkast eller ved en højere opløsning.
Image erhvervelse tid er en af de vigtigste (og dyreste) aspekter af 3D EM og bør derfor overvejes i eksperimentet design. Selvom det ikke er overraskende, at billeddannelse af store områder tager længere tid end billeddannelse af små områder, er det let at undervurdere virkningen: Afhængigt af de valgte billedbehandlingsparametre kan anskaffelsestiden på hvert afsnit variere fra sekunder til timer. Vigtige billedbehandlingsparametre omfatter størrelsen på syns-, opløsnings- og opholdstiden. Hvis der antages en målopløsning på 10nm pr. pixel og 1 μs, skal der billeddannelse et felt på 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm eller 500 μm x500 μm tager 4 sekunder, 100 sekunder eller 2.500 s at registrere. Vi kan gange disse billedtider pr. sektion med antallet af sektioner for at estimere den tid, der kræves til det komplette billedjob. Lange billedtider pr. sektion kan være acceptable, hvis antallet af sektioner er lille, eller hvis mikroskopværktøjstiden ikke giver anledning til bekymring.
Det er dog nødvendigt at begrænse registreringstiden til et overnatningsjob eller et weekendjob i de fleste tilfælde. Et lige så kritisk aspekt af 3D EM, der bør overvejes, er mængden og strukturen af de resulterende billeddata. Optagelse af ovennævnte billedfelter i 100 sektioner genererer henholdsvis 400 mb, 10 gb eller 250 gb billeddata. de 500 μm x 500 μm billeder udgør det ekstra problem at være større end 2 gb hver. Mange af de softwareprogrammer, der bruges til dataevaluering, kan ikke åbne billeder af denne størrelse.
For at reducere billedtiden er det vigtigt at vælge pixelbotid for at opfylde kravene til signal-til-støj-forholdet til den efterfølgende dataevaluering (f.eks. rekonstruktion, sporing) og begrænse optagelserne til definerede INVESTERINGSAFKAST. AT-udvidelsen af softwaren letter billedopsamling i små områder i serielle sektioner. Softwaren understøtter manuelle og automatiske arbejdsgange og mange halvautomatiske varianter: billedområder kan placeres manuelt og fokuseres på hvert afsnit, eller brugeren kan bruge den automatiske sektionsfinder og positionjusteringsfunktioner. Afhængigt af det automatiseringsniveau, der er valgt og understøttet af eksempeltypen eller billedmålene, kan den tid, der kræves til opsætning af billedopsamling i hundredvis af sektioner, tage en hel arbejdsdag (udført manuelt) eller kun få minutter. I princippet gør Array Tomography det mere udfordrende end andre 3D EM-metoder til at erhverve små INVESTERINGSAFKAST; Upræcise placering i regionen på sammenhængende strækninger skal kompenseres ved at erhverve større arealer. Hvis roi’et f.eks. er 20 μm x 20 μm i størrelse, og billeddannelsesfelternes sektion-til-sektionsposition er 10μm, skal man anskaffe 40 μm x 40 μm billeder for at være sikker på, at investeringsafkast er fuldt optaget i hvert billede på hvert afsnit. Den virkelige billedposition varierer fra 100 μm til <10 μm afhængigt af tilgængeligheden eller kvaliteten af softwarefunktioner til positionsjustering eller brugerens tålmodighed. Med denne software kan 10 μm opnås uden for meget manuel indgriben i de fleste prøver.
Som enhver teknik har AT flere svage punkter, der kan påvirke vellykket dataindsamling, og mange ligner andre sektionsbaserede metoder. Mangel på homogen fordeling af tom harpiks versus væv kan resultere i buede eller brudte arrays. I ekstreme tilfælde kan sektioner frigøre sig fra støtten (Figur 6A). Variabel komprimering eller strækning under skæreprocessen kan oprette folder, der kan forstyrre prøven i variable områder på efterfølgende afsnit (Figur 6B). Knivmærker kan forekomme på overfladen af de indsamlede sektioner ved hjælp af en beskadiget kniv (Figur 6C). Forskelle i sektionsforhold kan medføre lejlighedsvise sektionskomprimerings- og tykkelsesforskelle. Støv- eller snavspartikler kan lande på en sektion og delvis tilsløre interessezonen (Figur 6D). Billedopsamling kan mislykkes på grund af ufuldkomne funktioner med automatisk kontrast, automatisk fokus og automatisk stigmatisering. Placeringen af automatisk oprettede billedområder kan være variabel og kan muligvis ikke registrere investeringsafkast i alle sektioner.
Flere problemer kan opstå på tidspunktet for syninger og tilpasning. Den automatiske syning af mosaikfliser erhvervelser kan mislykkes, for eksempel på grund af den store tomme plads inde i prøven. På grund af en drastisk ændring i form i 3D kan billedstakke være udfordrende at registrere. Specialudviklede programmer (f.eks. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan lette halvautomatisk justering32,38,39,40. Mere udfordrende sektioner kan justeres manuelt ved hjælp af fotoredigeringssoftware. Desværre kan nogle datasæt være umulige at justere korrekt.
Store prøver er udfordrende for TEM serielle sektioner passer på gitre; På den anden side berettiger mange projekter ikke til lang automatisk erhvervelse ved hjælp af FIB/SEM eller SBF-SEM. AT er et ligetil alternativ til en kedelig seriel sektion TEM, hvor indsamling og manipulation af serielle sektioner på en wafer er mere ligetil end med slotgitre. Der blev udviklet flere strategier for at lette indsamlingen af arrays, og vi deler vores metode til at udvide den eksisterende værktøjskasse. I tilfælde, hvor identifikationen af investeringsafkast er udfordrende, giver AT-SEM en grundlæggende fordel med en effektiv screening af prøverne, hvor der kræves organelskalaopløsning på tværs af 50 til 500 sektioner. For større mængder kan de automatiske indsamlings-AT-strategier indsamles effektivt, hvis der kræves flere sektioner. AT prøver kan re-imaged flere gange, lette målrettet billeddannelse af områder med høj opløsning baseret på tidligere erhvervede oversigt billeder. Vi mener, at den målrettede analyse og reduceret oversampling af AT / SEM foreslået her reducerer arbejdskraft og datalagring krav. I sidste ende kan biblioteker af sektioner indsamles og vedligeholdes til senere genbrug og høring. Til volumenerhvervelse tilbyder FIB- eller SBF-SEM-tilgange en fremragende løsning, når investeringsafkast er let at identificere på blokfladen, eller hvis der er behov for store 3D-mængder til analysen. FIB/SBF-SEM er dog mindre effektive, når stakbilledet med høj opløsning skal indsamles fra et defineret investeringsafkast på en målrettet måde. Afslutningsvis vil jeg sige, at de foreslåede metoder til screening af AT-prøver og brugen af oversigtsbilleder med medium opløsning gør det muligt at begrænse billedopsamlingen til de relevante dele af sektionsmatrixen. Præcis sigte med billeddannelsesområder fremskynder time-to-data og forenkler dataevalueringen.
Sammenfattende, selv om begrebet AT / SEM ikke er nyt, dets anvendelse er stadig ikke så udbredt som dens fordele antyder. Samlet set giver den en supplerende procedure til andre eksisterende EM-metoder. AT/SEM er kompatibel med det bredeste udvalg af prøveforberedelsesprotokoller og billedbehandlingsarbejdsgange og kan udføres på enhver FIB/SEM eller SBF-SEM-mikroskop som en ledsagende teknik. I dette papir har vi koncentreret os om AT til registrering af ultrastrukturelle data fra prøver, der er mindre tilbøjelige til at blive behandlet med succes ved andre metoder. Vi håber, at den beskrevne procedure for bekvem indsamling af sektioner og betydeligt automatiserede erhvervelsesstrategier vil hjælpe i de første forsøg for dem, der aldrig har stødt på metoden og vil bidrage til at perfektionere den til dem, der allerede har en vis erfaring.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af EM-faciliteten ved universitetet i Lausanne for deres støtte under denne udvikling af forskellige trin i AT-proceduren. Vi vil gerne takke Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O’Brien og Lindsay Lewellyn for diskussioner under udarbejdelsen af manuskriptet og kritisk læsning. Vi vil gerne anerkende de grupper, der har bidraget med de prøver, der blev brugt til at demonstrere de forskellige scenarier: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat og Fanny Langlet.
Cutting | |||
AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
Image acquisition | |||
FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
Image analysis | |||
Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |