Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie
Summary
Ein offener Gefäßfensteransatz mit fluoreszierenden Tracern bietet eine ausreichende Auflösung für die Messung des Cochlea-Blutflusses (CoBF). Die Methode erleichtert die Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen.
Abstract
Die Schalltransduktion ist metabolisch anspruchsvoll, und die normale Funktion der Mikrovaskulatur in der Seitenwand ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des endocochleären Potenzials, des Ionentransports und des Flüssigkeitshaushalts. Es wird berichtet, dass verschiedene Formen von Hörstörungen eine abnormale Mikrozirkulation in der Cochlea beinhalten. Die Untersuchung, wie sich die Pathologie des Cochlea-Blutflusses (CoBF) auf die Hörfunktion auswirkt, ist aufgrund des Mangels an praktikablen Abfragemethoden und des schwierigen Zugangs zum Innenohr eine Herausforderung. Ein offenes Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, kombiniert mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, wurde zur Untersuchung von CoBF-Veränderungen in vivo verwendet, hauptsächlich jedoch bei Meerschweinchen und erst kürzlich in der Maus. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die offene Gefäßfenstermethode zur Visualisierung des Blutflusses in der Maus-Cochlea. Zu den Details gehören 1) Herstellung der fluoreszenzmarkierten Blutzellsuspension von Mäusen; 2) Konstruktion eines offenen Gefäßfensters für die intravitale Mikroskopie in einer anästhesierten Maus und 3) Messung der Blutflussgeschwindigkeit und des Blutvolumens mittels einer Offline-Aufzeichnung der Bildgebung. Die Methode wird im Videoformat präsentiert, um zu zeigen, wie der Open-Window-Ansatz in der Maus verwendet werden kann, um strukturelle und funktionelle Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
Introduction
Die normale Funktion der Mikrozirkulation in der lateralen Cochlea-Wand (die den Großteil der Kapillaren im Spiralband und in der Stria vascularis umfasst) ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Hörfunktion1. Abnorme CoBF ist an der Pathophysiologie vieler Innenohrerkrankungen beteiligt, einschließlich lärmbedingtem Hörverlust, Ohrhydrops und Presbyakusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Die Visualisierung der intravitalen CoBF ermöglicht ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen Hörfunktion und cochlea-vaskulärer Pathologie.
Obwohl die Komplexität und Lage der Cochlea im Schläfenbein eine direkte Visualisierung und Messung von CoBF ausschließt, wurden verschiedene Methoden zur Beurteilung von CoBF entwickelt, darunter Laser-Doppler-Durchflussmessung (LDF)10,11,12, Magnetresonanztomographie (MRT)13, intravitale Fluoreszenzmikroskopie (FIVM)14, Fluoreszenzmikroskopie (FME)15, endoskopische Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI)16 und Ansätze, die auf der Injektion markierter Marker und radioaktiv markierter Mikrosphären in den Blutkreislauf basieren (optische Mikroangiographie, OMAG)17,18,19,20. Keine dieser Methoden hat jedoch eine absolute Echtzeitverfolgung von Änderungen in CoBF in vivo ermöglicht, mit Ausnahme von FIVM. FIVM, in Kombination mit einem Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, ist ein Ansatz, der bei Meerschweinchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen von verschiedenen Laboratorien verwendet und validiert wurde 14,21,22.
Eine FIVM-Methode wurde erfolgreich etabliert, um die strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation in der Maus unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran als Kontrastmittel und einem Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen – entweder DiO (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grün) oder Dil (1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rot) – zur Vormarkierung von Blutzellen, zur Visualisierung von Gefäßen und zur Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit. In der vorliegenden Studie wurde das Protokoll dieser Methode zur Bildgebung und Quantifizierung von Veränderungen der CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen (z. B. nach Lärmexposition) beschrieben. Diese Technik gibt dem Forscher die notwendigen Werkzeuge an die Hand, um die zugrunde liegenden Mechanismen von CoBF im Zusammenhang mit Hörstörungen und Pathologie in der Stria vascularis zu untersuchen, insbesondere wenn sie in Verbindung mit leicht verfügbaren transgenen Mausmodellen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit zeigt, wie Kapillaren in der Cochlea-Seitenwand (und in der Stria vascularis) eines Mausmodells mit Fluorophormarkierung in einer offenen Gefäßfensterpräparation unter einem FIVM-System sichtbar gemacht werden können. Das Mausmodell ist weit verbreitet und wird als Säugetiermodell zur Untersuchung der menschlichen Gesundheit und Krankheit bevorzugt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein praktikabler Ansatz zur Bildgebung und Untersuchung von CoBF in der Mausseitenwand (insbesondere in der Striaa vascu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) und Medical Research Foundation der Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi) unterstützt.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
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