Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad
Summary
Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.
Abstract
De Drosophila melanogaster mannelijke embryonale gonade is een voordelig model om verschillende aspecten van ontwikkelingsbiologie te bestuderen, waaronder, maar niet beperkt tot, kiemcelontwikkeling, piRNA-biologie en nichevorming. Hier presenteren we een dissectietechniek om de gonade ex vivo live in beeld te brengen tijdens een periode waarin in vivo live-imaging zeer ineffectief is. Dit protocol schetst hoe embryo’s naar een beeldvormingsschaal kunnen worden overgebracht, de juiste geënsceneerde mannelijke embryo’s kunnen worden gekozen en de geslachtsklier uit het omliggende weefsel kan worden ontleed met behoud van de structurele integriteit. Na dissectie kunnen geslachtsklieren worden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop om dynamische cellulaire processen te visualiseren. De dissectieprocedure vereist een nauwkeurige timing en behendigheid, maar we geven inzicht in hoe veelvoorkomende fouten kunnen worden voorkomen en hoe deze uitdagingen kunnen worden overwonnen. Voor zover wij weten is dit het eerste dissectieprotocol voor de Drosophila embryonale gonade en zal live-imaging mogelijk maken tijdens een anders ontoegankelijk tijdsvenster. Deze techniek kan worden gecombineerd met farmacologische of celtype specifieke transgene manipulaties om dynamische processen te bestuderen die zich voordoen in of tussen de cellen in hun natuurlijke gonadale omgeving.
Introduction
De Drosophila melanogaster testis heeft gediend als een paradigma voor ons begrip van vele dynamische cellulaire processen. Studies van dit model hebben lichtgeworpen op stamceldelingsregulatie 1,2,3, kiemcelontwikkeling 4,5, piRNA-biologie 6,7,8 en niche-stamcelsignaleringsgebeurtenissen 9,10,11,12,13. Dit model is voordelig omdat het genetisch handelbaar is14,15 en een van de weinige is waar we stamcellen in hun natuurlijke omgeving kunnen live-imagen 3,16,17,18. Live-imaging van dit model is echter beperkt tot volwassen weefsel en vroege embryonale stadia, waardoor er een gat is in onze kennis van gonadale dynamiek in het late embryo, het precieze stadium waarin de niche zich voor het eerst vormt en begint te functioneren.
De embryonale gonade in een laat stadium is een bol, bestaande uit somatische nichecellen aan de voorzijde en geslachtscellen die door somatische gonadale cellen in meer achterste regio’s worden geënt19. Dit orgaan kan live in vivo worden afgebeeld tot vroeg embryonaal stadium 17 17,20,21. Verdere beeldvorming wordt voorkomen door het initiëren van grootschalige spiercontracties. Deze weeën zijn zo ernstig dat ze de gonade uit het beeldvormingsframe duwen en een dergelijke beweging kan niet worden gecorrigeerd met beeldvormingssoftware. Ons lab is geïnteresseerd in het onthullen van de mechanismen van nichevorming, die plaatsvindt tijdens deze ongrijpbare periode voor live-imaging. Daarom hebben we een ex vivo benadering gegenereerd om de gonade levend in beeld te brengen vanaf embryonale fase 16, waardoor de studie van de celdynamiek tijdens deze cruciale periode van gonadeontwikkeling wordt vergemakkelijkt. Eerder werk uit ons laboratorium toont aan dat deze ex vivo beeldvorming de ontwikkeling van in vivo gonaden17 getrouw weergeeft. Deze techniek is de eerste en enige in zijn soort voor de Drosophila embryonale geslachtsklier.
Hier presenteren we het dissectieprotocol dat nodig is voor ex vivo live-beeldvorming van de gonade tijdens late embryonale stadia. Dit protocol kan worden gecombineerd met farmacologische behandelingen of transgene manipulatie van specifieke cellijnen in de gonade. Met behulp van deze techniek hebben we met succes de stappen van stamcelnichevorming17 in beeld gebracht. Deze beeldvormingsbenadering is dus instrumenteel voor het gebied van stamcelbiologie, omdat het visualisatie van de beginfasen van nichevorming in realtime binnen zijn natuurlijke omgeving mogelijk maakt15,17. Hoewel deze methode gunstig is voor het gebied van stamcelbiologie, is het ook van toepassing op het visualiseren van dynamische processen die zich tijdens dit ontwikkelingstijdpunt in de gonade voordoen, inclusief cellulaire herschikkingen22, celadhesie 2,12,23 en celmigratie23. Dit dissectieprotocol zal dus ons begrip van vele fundamentele celbiologische processen vergroten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de gogonadogenese ondergaat de embryonale gonade, en met name de stamcelniche in de mannelijke geslachtsklier15, snelle morfologische veranderingen. Ontwikkelingsmechanismen die ten grondslag liggen aan deze dynamische veranderingen worden het best begrepen door middel van live-imaging technieken. In embryonaal stadium 17 wordt in vivo beeldvorming van de gonade echter onmogelijk gemaakt door het begin van grootschalige spiercontracties17. Met dit protocol …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Lindsey W. Plasschaert en Justin Sui bedanken voor hun substantiële bijdragen aan de vroege ontwikkeling van dit protocol. De auteurs zijn de vlieggemeenschap dankbaar voor hun vrijgevigheid met reagentia, en in het bijzonder Ruth Lehmann en Benjamin Lin voor hun geschenk van de nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′-lijn voorafgaand aan de publicatie ervan. Aandelen verkregen van het Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) werden gebruikt in deze studie. Dit werk werd ondersteund door NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 en R35GM136270 (S.D), evenals trainingsbeurzen T32GM007229 (B.W.) en F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
Referências
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Biologia do Desenvolvimento. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Biologia do Desenvolvimento. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer’s solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
