Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais
Summary
Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.
Abstract
A geração de cardiomiócitos humanos (CMs), fibroblastos cardíacos (CFs) e células endoteliais (CE) de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) proporcionou uma oportunidade única para estudar a interação complexa entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsionam o desenvolvimento de tecidos e doenças. Na área de modelos de tecido cardíaco, várias abordagens tridimensionais sofisticadas (3D) usam cardiomiócitos pluripotentes induzidos derivados de células-tronco (iPSC-CMs) para imitar relevância fisiológica e ambiente de tecido nativo com uma combinação de matrizes extracelulares e crosslinkers. No entanto, esses sistemas são complexos para fabricar sem experiência em microfabização e requerem várias semanas para se auto-montar. Mais importante, muitos desses sistemas não possuem células vasculares e fibroblastos cardíacos que compõem mais de 60% dos não-miócitos no coração humano. Aqui descrevemos a derivação de todos os três tipos de células cardíacas de iPSCs para fabricar microtissues cardíacas. Esta técnica de moldagem de réplica fácil permite a cultura de microtissue cardíaco em placas de cultura celular multi-bem padrão por várias semanas. A plataforma permite o controle definido pelo usuário sobre tamanhos de microtissue com base na densidade inicial de semeadura e requer menos de 3 dias para que a automontagem atinja contrações microtissuas cardíacas observáveis. Além disso, as microtissues cardíacas podem ser facilmente digeridas, mantendo alta viabilidade celular para interrogatório unicelular com o uso de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Imaginamos que este modelo in vitro de microtissues cardíacas ajudará a acelerar os estudos de validação na descoberta de medicamentos e modelagem de doenças.
Introduction
A descoberta de medicamentos e a modelagem de doenças no campo da pesquisa cardiovascular enfrentam diversos desafios devido à falta de amostras clinicamente relevantes e ferramentas translacionais inadequadas1. Modelos pré-clínicos altamente complexos ou supersimplificados em modelos de célula única in vitro não apresentam condições fisiocessiológicas de forma reprodutível. Portanto, várias plataformas miniaturizadas projetadas em tecido evoluíram para ajudar a preencher a lacuna, com o objetivo de alcançar um equilíbrio entre a facilidade de aplicação de forma de alta produtividade e a recapitulação fiel da função tecidual2,3. Com o advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), as ferramentas de engenharia de tecidos podem ser aplicadas a células específicas do paciente com ou sem estado de doenças cardiovasculares subjacentes para responder a perguntas de pesquisa4,5,6. Tais modelos de tecido projetado com composição celular semelhante ao tecido cardíaco poderiam ser utilizados em esforços de desenvolvimento de medicamentos para testar para cardiotoxicidade e disfunção induzida por alterações patológicas no comportamento de um ou vários tipos de células.
Microtissues auto-montados ou organoides derivados de iPSCs humanos são estruturas tridimensionais (3D) que são conjuntos em miniatura semelhantes a tecidos que exibem semelhanças funcionais com suas contrapartes in vivo. Existem várias abordagens diferentes que permitem a formação de organoides in situ via diferenciação direcionada de iPSCs ou através da formação de corpos embrióides4. Os organoides resultantes são uma ferramenta indispensável para estudar processos morfogenéticos que impulsionam a organogênese. No entanto, a presença de uma variedade de populações celulares e diferenças na auto-organização podem levar à variabilidade nos desfechos entre diferentes organoides5. Alternativamente, células pré-diferenciadas que são auto-montadas em microtissues com tipos de células específicas do tecido para estudar interações células locais são excelentes modelos, onde é viável isolar os componentes auto-montados. Particularmente em pesquisas cardíacas humanas, o desenvolvimento de microtissues cardíacas 3D com componentes multicelulares provou ser desafiador quando as células são derivadas de diferentes linhas de pacientes ou fontes comerciais.
Para melhorar nossa compreensão mecanicista dos comportamentos celulares em um modelo fisiologicamente relevante, personalizado e in vitro, idealmente todos os tipos de células componentes devem ser derivados da mesma linha de pacientes. No contexto de um coração humano, um modelo in vitro cardíaco verdadeiramente representativo capturaria o crosstalk entre tipos de células predominantes, ou seja, cardiomócitos (CMs), células endoteliais (CE) e fibroblastos cardíacos (CFs)6,7. A recapitulação fiel de um miocárdio não requer apenas alongamento biofísico e estimulação eletrofisiológica, mas também sinalização celular-célula que surge de tipos celulares de suporte como ECs e CFs8. Os CFs estão envolvidos na síntese da matriz extracelular e na manutenção da estrutura tecidual; e em estado patológico, os CFs podem induzir a fibrose e alterar a condução elétrica nos CMs9. Da mesma forma, as CE podem regular propriedades contratuais de CMs através de sinalização paracrina e fornecimento de demandas metabólicas vitais10. Portanto, há a necessidade de microtissues cardíacas humanas compostas por todos os três principais tipos de células para permitir que experimentos fisiologicamente relevantes de alta produtividade sejam realizados.
Aqui, descrevemos uma abordagem inferior na fabricação de microtissues cardíacas por derivação de cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs), células endoteliais derivadas do iPSC (iPSC-ECs) e fibroblastos cardíacos derivados do iPSC (iPSC-CFs) e sua cultura 3D em microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de gerar microtissues cardíacas espontaneamente pode ser utilizado para modelagem de doenças e testes rápidos de drogas para compreensão funcional e mecanicista da fisiologia cardíaca. Além disso, tais plataformas multicelulares de microtissue cardíacas poderiam ser exploradas com técnicas de edição de genomas para emular a progressão de doenças cardíacas ao longo do tempo sob condições crônicas ou agudas de cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para gerar microtissues cardíacas a partir de iPSC-CMs pré-diferenciados, iPSC-CEs e iPSC-CFs, é essencial obter uma cultura altamente pura para um melhor controle dos números celulares após a compactação celular inibida pelo contato dentro das microtissues cardíacas. Recentemente, Giacomelli et. al.18 demonstraram a fabricação de microtissues cardíacas utilizando iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs. As microtissues cardíacas geradas usando o método descrito consistem em ~5.000 células (70…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Dra. O apoio ao financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP) da Universidade da Califórnia, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
Referências
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