Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis
Summary
Qui, descriviamo i metodi per iniezioni pupali e adulte efficienti in Nasonia vitripennis come alternative accessibili alla microiniezione embrionale, consentendo l’analisi funzionale dei geni di interesse utilizzando il silenziamento dell’RNA tramite interferenza dell’RNA (RNAi) o knockout genico tramite l’editing del genoma CRISPR / Cas9.
Abstract
La vespa gioiello, Nasonia vitripennis, è diventata un efficiente sistema modello per studiare l’epigenetica della determinazione del sesso aplo-diploide, la biologia cromosomica B, le interazioni ospite-simbionte, la speciazione e la sintesi del veleno. Nonostante la disponibilità di diversi strumenti molecolari, tra cui CRISPR/Cas9, gli studi genetici funzionali sono ancora limitati in questo organismo. La principale limitazione dell’applicazione della tecnologia CRISPR/Cas9 in N. vitripennis deriva dalle sfide delle microiniezioni embrionali. Le iniezioni di embrioni sono particolarmente difficili in questo organismo e in generale in molte vespe parassitoidi, a causa delle piccole dimensioni dell’embrione e del requisito di una pupa ospite per lo sviluppo embrionale. Per affrontare queste sfide, cas9 ribonucleoproteina consegna complessa nelle ovaie femminili per iniezione adulta, piuttosto che microiniezione embrionale, è stato ottimizzato, con conseguente modifica della linea germinale somatica ed ericolabile. Le procedure di iniezione sono state ottimizzate nelle pupe e nelle vespe femminili utilizzando remot control (trasduzione ovarica mediata dal recettore del carico) o BAPC (capsule peptidiche anfifile ramificate). Questi metodi si dimostrano efficaci alternativi all’iniezione embrionale, consentendo mutazioni germinali site-specific ed heritable.
Introduction
L’editing genico CRISPR/Cas9 è una potente tecnologia per studi genetici funzionali, specialmente in molti organismi modello in ascesa come la vespa gioiello Nasonia vitripennis. La facilità di allevamento e la disponibilità di un genoma completo rendono la vespa gioiello un importante sistema sperimentale per chiarire i meccanismi molecolari dei diversi processi biologici. Ad esempio, N. vitripennis è stato recentemente utilizzato per svelare la base epigenetica del sistema di determinazione sessuale aplodiploide1,2, la biologia dei cromosomi B3,4,5,6e la base genetica per la regolazione circadiana estagionale 7,8. Alcune delle caratteristiche che rendono N. vitripennis suscettibile di lavorare includono tempi di breve generazione (~ 2 settimane a 25 °C), alti tassi di riproduzione, facile separazione sessuale nella fase pupale e la capacità di diapausa e conservare ceppi a 4 °C. Il ciclo di vita inizia con le vespe femminili che parassitano le pupe della mosca soffiata, Sarcofago bullata. Attraverso il loro ovopositore, le femmine depongono fino a 50 uova nel caso pupale della mosca. Le uova si sviluppano in larve che si nutrono della pupa di S. bullata, continuano a svilupparsi nei prossimi giorni e poi si impupano, seguite dall’eclosion adulta e dall’emergere dal pupariumospite 9.
Sono disponibili strumenti molecolari per eseguire studi genetici funzionali in N. vitripennis, come l’interferenza dell’RNA (RNAi)10 e CRISPR/Cas911, 12, ma sono limitati, principalmente a causa delle difficoltà nell’esecuzione di microiniezioni embrionali13. Poiché le uova di N. vitripennis richiedono un ospite pupale per lo sviluppo, la manipolazione delle uova è molto impegnativa. Gli embrioni allo stadio pre-blastoderma devono essere raccolti dalle pupe della mosca soffiata ospite, rapidamente microiniettati e immediatamente trasferiti all’ospite per lo sviluppo13. Questi passaggi richiedono precisione e allenamento specializzato per evitare di danneggiare gli embrioni microiniettati o gli ospiti pupali13. Inoltre, le uova sono molto piccole e fragili, specialmente dopo le microiniezioni, con un citoplasma molto viscoso che causa un intasamento continuo dell’ago iniettabile13. Queste caratteristiche rendono le microiniezioni embrionali eccezionalmente impegnative, richiedendo operatori altamente qualificati e attrezzature specializzate assenti nella maggior parte dei laboratori N. vitripennis.
L’ottimizzazione di metodi di iniezione alternativi per la consegna di reagenti CRISPR contribuirebbe al consolidamento di N. vitripennis come organismo modello. La manipolazione di pupe e adulti è meno impegnativa rispetto alla manipolazione degli embrioni e può essere eseguita con una configurazione di iniezione di base. Qui vengono descritti due protocolli per l’iniezione di pupe e adulti: uno che coinvolge attrezzature specializzate per iniezioni e l’altro che comporta l’uso di un gruppo di tubi aspiratori dotato di un ago capillare in vetro. L’uso di un tubo aspiratore è particolarmente adatto per i laboratori che non hanno accesso a apparecchiature specializzate per microiniezioni embrionale. Vengono dimostrate iniezioni efficienti di diverse fasi di sviluppo di N. vitripennis, tra cui pupe bianche o nere e vespe adulte. Le vespe allo stadio pupale bianco sono particolarmente adatte per esperimenti di abbattimento mediati da RNAi. Sebbene RNAi in Nasonia sia stato descritto per la prima volta da Lynch e Desplan nel 200610, non è disponibile alcuna procedura visiva per il modo in cui vengono eseguite le iniezioni RNAi. RNAi è stato recentemente utilizzato per scoprire il gene aploidizzatore del PSR del cromosoma B (Rapporto sessuale paterno)3 e per studiare il coinvolgimento del gene dell’orologio, periodo, nei ritmi biologici N. vitripennis 7.
Pupe nere e vespe adulte possono essere utilizzate per indurre l’editing genico della linea germinale CRISPR /Cas9 utilizzando protocolli ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) e BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Questi due metodi di somministrazione dell’ovaio sono stati recentemente descritti come efficaci in Nasonia per generare mutazioni germinali nel gene bersaglio, cinabro7,12. Qui, viene fornito un protocollo semplificato per le iniezioni che include una procedura visiva di una metodologia passo-passo per iniezioni sia pupali che adulte che possono essere utilizzate per generare studi di genetica funzionale a Nasonia e probabilmente in altre vespe parassitoidi, senza richiedere attrezzature specializzate e bypassando le microiniezioni embrionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con il recente aumento dell’uso di Nasonia vitripennis come organismo modello per varie questioni biologiche2,3,7,17, è necessario sviluppare e ottimizzare metodi di iniezione per consentire un protocollo semplificato ed efficiente per l’analisi funzionale dei geni N. vitripennis. Gli attuali metodi che prevedono la microiniezione embrionale di reagenti per l’editing genico<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da fondi di avviamento UCSD diretti a O.S.A. e NSF/BIO 1645331 a J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
Referências
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
