नासोनिया विट्रिपेनिस में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन
Summary
यहां, हम भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुलभ विकल्प के रूप में नासोनिया vitripennis में कुशल प्यूपल और वयस्क इंजेक्शन के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) या CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के माध्यम से जीन नॉकआउट के माध्यम से या तो आरएनए-मुंह से बाहर का उपयोग कर ब्याज के जीन के कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं ।
Abstract
गहना ततैया, नासोनिया विट्रीपेनिस,हैप्लो-डिप्लोइड सेक्स निर्धारण, बी-गुणसूत्र जीव विज्ञान, मेजबान-सहजीवी इंटरैक्शन, स्पेसाइजेशन और विष संश्लेषण के एपिजेनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल प्रणाली बन गया है। CRISPR/Cas9 सहित कई आणविक उपकरणों की उपलब्धता के बावजूद, कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन अभी भी इस जीव में सीमित हैं । एन vitripennis में CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी लागू करने की प्रमुख सीमा भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन की चुनौतियों से उपजी है । भ्रूण के इंजेक्शन इस जीव में विशेष रूप से मुश्किल हैं और सामान्य रूप से कई परजीवी घास में, छोटे भ्रूण के आकार और भ्रूण विकास के लिए एक मेजबान पिल्ला की आवश्यकता के कारण। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन के बजाय वयस्क इंजेक्शन द्वारा महिला अंडाशय में Cas9 रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन जटिल वितरण को अनुकूलित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप दैहिक और वंशानुगत जर्नलिन दोनों संपादन हुए । इंजेक्शन प्रक्रियाओं को रिमोट नियंत्रण (रिसेप्टर-मध्यस्थता अंडाशय के कार्गो) या बीएपीसी (ब्रांच्ड एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल) का उपयोग करके प्यूप और मादा घास में अनुकूलित किया गया था। इन तरीकों को भ्रूण इंजेक्शन के लिए प्रभावी विकल्प दिखाया गया है, साइट विशिष्ट और वंशानुबल जर्मलाइन म्यूटेशन को सक्षम करने के लिए ।
Introduction
CRISPR/Cas9 जीन संपादन कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, विशेष रूप से गहना ततैया, नासोनिया vitripennisजैसे कई बढ़ते मॉडल जीवों में । पालन की आसानी और एक पूर्ण जीनोम की उपलब्धता गहना ततैया विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रणाली बनाता है। उदाहरण के लिए, एन विट्रीपेनिस का उपयोग हाल ही में हैपिडिप्लॉयड लिंग निर्धारण प्रणाली 1 ,2,बी-क्रोमोसोम 3 ,4,5,6 के जीव विज्ञान और सर्कैडियन और मौसमी विनियमन7,8के आनुवंशिक आधार के एपिजेनेटिक आधार को जानने के लिए किया गया है। एन विट्रिपेनिस को काम करने के लिए उत्तरदायी बनाने वाली कुछ विशेषताओं में कम पीढ़ी का समय (~ 2 सप्ताह 25 डिग्री सेल्सियस), उच्च प्रजनन दर, प्यूपल चरण में आसान सेक्स अलगाव, और 4 डिग्री सेल्सियस पर उपभेदों को डायपोज़ और स्टोर करने की क्षमता शामिल है। जीवन चक्र मादा घास के साथ शुरू होता है जो ब्लोफ्लाई, सरकोफागा बुलटाके पिल्ले को परजीवी करता है। अपने ओविपोसिटर के माध्यम से, मादाएं ब्लोफ्लाई के प्यूपल मामले में 50 अंडे तक डालती हैं। अंडे लार्वा में विकसित होते हैं जो एस बुलटा पिल्ला पर फ़ीड करते हैं, अगले कई दिनों में विकसित होते रहते हैं, और फिर प्यूपेट करते हैं, इसके बाद वयस्क एक्लेशन और मेजबान प्यूपरियम 9 से उद्भवहोताहै।
एन विट्रीपेनिसमें कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन करने के लिए आणविक उपकरण, जैसे आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई)10 और CRISPR/Cas911,12,उपलब्ध हैं, लेकिन मुख्य रूप से भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन13प्रदर्शन में कठिनाइयों के कारण सीमित हैं । चूंकि एन विट्रिपेनिस अंडे को विकास के लिए एक प्यूपल होस्ट की आवश्यकता होती है, अंडे में हेरफेर बहुत चुनौतीपूर्ण है। प्री-ब्लास्टोडर्म चरण भ्रूण मेजबान ब्लोफ्लाई प्यूप से एकत्र किए जाने चाहिए, जल्दी से माइक्रोइंजेक्टेड, और तुरंत विकास13के लिए मेजबान को वापस स्थानांतरित कर दिया जाना चाहिए। इन कदमों के लिए सटीक और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है ताकि सूक्ष्मजेक्टेड भ्रूणों को नुकसान पहुंचाया जा सके या प्यूपल13की मेजबानी कर सके । इसके अलावा, अंडे बहुत छोटे और नाजुक होते हैं, विशेष रूप से माइक्रोइंजेक्शन के बाद, एक बहुत ही चिपचिपा साइटोप्लाज्म के साथ इंजेक्शन सुई13का निरंतर क्लोजिंग होता है। ये विशेषताएं भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन को असाधारण रूप से चुनौतीपूर्ण बनाती हैं, जिन्हें अत्यधिक प्रशिक्षित ऑपरेटरों और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है जो अधिकांश एन विट्रिपेनिस प्रयोगशालाओं में अनुपस्थित हैं।
CRISPR अभिकर्मकों के वितरण के लिए वैकल्पिक इंजेक्शन विधियों का अनुकूलन एक मॉडल जीव के रूप में एन विट्रिपेनिस के समेकन में योगदान देगा। Pupae और वयस्कों के हेरफेर भ्रूण हेरफेर की तुलना में कम चुनौतीपूर्ण है और एक बुनियादी इंजेक्शन सेटअप के साथ पूरा किया जा सकता है । यहां, पिल्ले और वयस्कों के इंजेक्शन के लिए दो प्रोटोकॉल वर्णित हैं: एक इंजेक्शन के लिए विशेष उपकरण शामिल है, और दूसरा एक एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली का उपयोग शामिल है जो ग्लास केशिका सुई के साथ लगे हैं। एस्पिरेटर ट्यूब का उपयोग विशेष रूप से प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूल है जिनके पास भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए विशेष उपकरण तक पहुंच नहीं है। सफेद या काले पिल्ले और वयस्क घास सहित एन वित्रिपेनिसके विभिन्न विकासात्मक चरणों के कुशल इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाता है। सफेद प्यूपल चरण में वासप्स विशेष रूप से आरएनएआई-मध्यस्थता नॉकडाउन प्रयोगों के लिए अनुकूल हैं। हालांकि नासोनिया में आरएनएआई को पहली बार 200610में लिंच और डेसप्लान द्वारा वर्णित किया गया था, लेकिन आरएनएआई इंजेक्शन कैसे किए जाते हैं, इसके लिए कोई दृश्य प्रक्रिया उपलब्ध नहीं है। आरएनएआई का उपयोग हाल ही में बी-क्रोमोसोम पीएसआर (पैतृक लिंग अनुपात)3 के हैप्लॉयाइजर जीन की खोज करने और एन विट्रीपेनिस जैविक लय7में घड़ी जीन, अवधिकी भागीदारी का अध्ययन करने के लिए किया गया था।
ब्लैक प्यूप और वयस्क घास का उपयोग रिमोट कंट्रोल (रिसेप्टर-मध्यस्थता अंडाशय के कार्गो) और बीएपीसी (ब्रांच्ड एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल) प्रोटोकॉल का उपयोग करके CRISPR/Cas9 जर्मलाइन जीन संपादन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। इन दो अंडाशय वितरण विधियों को हाल ही में नासोनिया में लक्षित जीन, सिनाबार7,12में जर्मलाइन उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए प्रभावी बताया गया है । यहां, इंजेक्शन के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जिसमें प्यूपल और वयस्क इंजेक्शन दोनों के लिए कदम-दर-कदम पद्धति की एक दृश्य प्रक्रिया शामिल है जिसका उपयोग नासोनिया में कार्यात्मक आनुवंशिकी अध्ययन उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है और अन्य परजीवी घास में होने की संभावना, विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना और भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन को दरकिनार किए बिना।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभिन्न जैविकप्रश्नों2, 3,7,17के लिए एक मॉडल जीव के रूप में नासोनिया विट्रीपेनिस के हालिया बढ़ते उपयोग के साथ, एन विट्रीपेनिस जीन के कार्यात्मक विश?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूसीएसडी स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थन दिया गया था, जो जेएलआर को 1645331 O.S.A. और एनएसएफ/बायो ग्रांट को निर्देशित किया गया था ।
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
Referências
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
