Pupal och vuxna injektioner för RNAi och CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis
Summary
Här beskriver vi metoder för effektiva poppal- och vuxeninjektioner i Nasonia vitripennis som tillgängliga alternativ till embryomikroinjektion, vilket möjliggör funktionell analys av gener av intresse med antingen RNA-ljuddämpande via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelstepsen Nasonia vitripennishar blivit ett effektivt modellsystem för att studera epigenetik av haplo-diploid könsbestämning, B-kromosombiologi, värd symbiont interaktioner, speciation och giftsyntes. Trots tillgången på flera molekylära verktyg, inklusive CRISPR/Cas9, är funktionella genetiska studier fortfarande begränsade i denna organism. Den största begränsningen av tillämpningen av CRISPR/Cas9-teknik i N. vitripennis härrör från utmaningarna med embryonala mikroinjektioner. Injektioner av embryon är särskilt svåra i denna organism och i allmänhet i många parasitoidsteps, på grund av liten embryostorlek och kravet på en värdvalpa för embryonal utveckling. För att ta itu med dessa utmaningar optimerades Cas9 ribonukleoprotein komplexa leverans till kvinnliga äggstockar genom vuxna injektion, snarare än embryonal microinjection, vilket resulterar i både somatiska och ärftliga könsceller redigeringar. Injektionsprocedurerna optimerades i poppar och kvinnliga kastare med antingen ReMOT Control (Receptor-medierad äggstockstransduktion av last) eller BAPC (Grenade amfifila peptidkapslar). Dessa metoder visas vara effektiva alternativ till embryoinjektion, vilket möjliggör platsspecifika och ärftliga könsceller mutationer.
Introduction
CRISPR/ Cas9 genredigering är en kraftfull teknik för funktionella genetiska studier, särskilt i många stigande modellorganismer som juvelstepsen Nasonia vitripennis. Den enkla uppfödningen och tillgången till ett komplett genom gör juvelvingen till ett viktigt experimentellt system för att belysa de molekylära mekanismerna i olika biologiska processer. Till exempel har N. vitripennis nyligen använts för att riva upp den epigenetiska grunden för haplodiploid sexbestämningssystem1,2, biologin hos B-kromosomer3,4,5,6, och den genetiska grunden för dygnsrytm och säsongsreglering7,8. Några av de funktioner som gör N. vitripennis mottagliga för att arbeta med inkluderar kort generationstid (~ 2 veckor vid 25 °C), höga reproduktionshastigheter, enkel könsseparation på pupalstadiet och förmågan att diapause och lagra stammar vid 4 °C. Livscykeln börjar med kvinnliga tjurar som parasiterar blåsflyens puppar, Sarcophaga bullata. Genom sin ovipositor lägger kvinnor upp till 50 ägg i pupal fallet med blåsflyen. Ägg utvecklas till larver som matar på S. bullata poppa, fortsätter att utvecklas under de kommande dagarna och sedan popp, följt av vuxen eclosion och uppkomst från värden puparium9.
Molekylära verktyg för att utföra funktionella genetiska studier i N. vitripennis, såsom RNA-interferens (RNAi)10 och CRISPR / Cas911,12, finns tillgängliga, men är begränsade, främst på grund av svårigheter att utföra embryonala mikroinjektioner13. Eftersom N. vitripennis ägg kräver en pupal värd för utveckling, är äggmanipulation mycket utmanande. Embryon före blastodermstadiet måste samlas in från värdens blåsflytuppar, snabbt mikroin injiceras och omedelbart överföras tillbaka till värden för utveckling13. Dessa steg kräver precision och specialiserad utbildning för att undvika att skada de mikroinjected embryona eller pupal värdarna13. Dessutom är äggen mycket små och bräckliga, särskilt efter mikroinjektioner, med en mycket trögflytande cytoplasma som orsakar en kontinuerlig igensättning av injektionsnålen13. Dessa funktioner gör embryonala mikroinjektioner exceptionellt utmanande, vilket kräver högutbildade operatörer och specialiserad utrustning som saknas i de flesta N. vitripennis-laboratorier.
Optimeringen av alternativa injektionsmetoder för leverans av CRISPR-reagenser skulle bidra till konsolideringen av N. vitripennis som modellorganism. Manipulering av puppar och vuxna är mindre utmanande än att manipulera embryon och kan åstadkommas med en grundläggande injektionsinställning. Här beskrivs två protokoll för injektion av puppar och vuxna: en som omfattar specialiserad utrustning för injektioner och den andra som inbegriper användning av en aspiratorrörsenhet utrustad med en glaskapillär nål. Användningen av ett aspiratorrör är särskilt lämplig för laboratorier som inte har tillgång till specialiserad utrustning för embryomikroinjektioner. Effektiva injektioner av olika utvecklingsstadier av N. vitripennis, inklusive vita eller svarta poppar och vuxna stekar, påvisas. Varpsar på det vita pupalstadiet är särskilt lämpade för RNAi-medierade knockdown-experiment. Även om RNAi i Nasonia först beskrevs av Lynch och Desplan 200610, finns det ingen visuell procedur tillgänglig för hur RNAi injektioner utförs. RNAi användes nyligen för att upptäcka haploidizergenen av B-kromosom PSR (Paternal Sex Ratio)3 och för att studera inblandning av klockgenen, period, i N. vitripennis biologiska rytmer7.
Svarta puppar och vuxna kastare kan användas för att inducera CRISPR/Cas9-germlin genredigering med remotkontroll (receptormedierad äggstockstransduktion av last) och BAPC -protokoll (branched amphiphilic peptidkapslar). Dessa två äggstocksleveransmetoder har nyligen beskrivits vara effektiva i Nasonia för att generera könsceller mutationer i mål genen, cinnabar7,12. Här finns ett förenklat protokoll för injektioner inklusive ett visuellt förfarande av en steg-för-steg-metodik för både poppal och vuxna injektioner som kan användas för att generera funktionella genetikstudier i Nasonia och sannolikt i andra parasitoidsteps, utan att kräva specialiserad utrustning och kringgå embryonala mikroinjektioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den senaste tidens ökade användning av Nasonia vitripennis som modellorganism för olika biologiska frågor2,3,7,17, finns det ett behov av att utveckla och optimera injektionsmetoder för att möjliggöra ett förenklat och effektivt protokoll för funktionell analys av N. vitripennis gener. De nuvarande metoderna som involverar embryonal mikroinjektion av genredigering…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av UCSD-startfonder riktade till O.S.A. och NSF/ BIO-1645331 till J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
Referências
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
