Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique
Summary
Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .
Abstract
Traditionnellement utilisés pour les essais biochimiques en vrac, les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont devenus un puissant outil basé sur l’imagerie pour étudier les phénomènes cytoplasmiques, tels que la cytokinèse, la formation de fuseau mitotique et l’assemblage du noyau. S’appuyant sur les premières méthodes qui ont imagé des extraits fixes échantillonnés à des points temporels clairsemés, les approches récentes imagent des extraits vivants en utilisant la microscopie accélérée, révélant des caractéristiques plus dynamiques avec une résolution temporelle améliorée. Ces méthodes nécessitent généralement des traitements de surface sophistiqués du vaisseau d’imagerie. Nous présentons ici une méthode alternative pour l’imagerie en direct d’extraits d’œufs qui ne nécessitent aucun traitement de surface chimique. Il est simple à mettre en œuvre et utilise des consommables de laboratoire produits en série pour l’imagerie. Nous décrivons un système qui peut être utilisé à la fois pour la microscopie à grand champ et la microscopie confocale. Il est conçu pour l’imagerie d’extraits dans un champ 2 dimensions (2D), mais peut être facilement étendu à l’imagerie en 3D. Il est bien adapté pour étudier la formation de motifs spatiaux dans le cytoplasme. Avec des données représentatives, nous démontrons l’organisation dynamique typique des microtubules, noyaux et mitochondries dans des extraits interphasiques préparés à l’aide de cette méthode. Ces données d’images peuvent fournir des informations quantitatives sur la dynamique cytoplasmique et l’organisation spatiale.
Introduction
Le cytoplasme constitue le volume principal d’une cellule et a une organisation distincte. Les ingrédients du cytoplasme eucaryote peuvent s’auto-assembler en un large éventail de structures spatiales, telles que les asters de microtubules et l’appareil de Golgi, qui à leur tour sont disposés dynamiquement et retournés en fonction de l’identité et de l’état physiologique de la cellule. Comprendre l’organisation spatiale du cytoplasme et son lien avec les fonctions cellulaires est donc important pour comprendre le fonctionnement de la cellule. Les extraits d’œufs de Xenopus laevis ont traditionnellement été utilisés pour des essais biochimiques en vrac 1,2,3,4,5,6,7,8, mais des travaux récents les établissent comme un puissant système d’imagerie en direct pour les études mécanistes des structures cytoplasmiques et de leurs fonctions cellulaires 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Ces extraits non dilués préservent de nombreuses structures et fonctions du cytoplasme, tout en permettant des manipulations directes du contenu cytoplasmique non réalisables dans les modèles cellulaires conventionnels19,20. Cela les rend idéales pour caractériser les phénomènes cytoplasmiques et disséquer leurs fondements mécanistes.
Les méthodes existantes d’imagerie des extraits nécessitent des modifications chimiques de surface ou la fabrication de dispositifs microfluidiques. Une méthode basée sur les lamelles de couverture nécessite une passivation en polyéthylène glycol (PEG) des lamelles de verre21. Une méthode basée sur la microémulsion nécessite un dépôt en phase vapeur de trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sur des surfaces vitrées22,23. Les systèmes microfluidiques permettent un contrôle précis du volume, de la géométrie et de la composition des gouttelettes d’extrait, mais nécessitent des installations de microfabrication spécialisées11,12,24.
Ici, nous introduisons une méthode alternative d’imagerie des extraits d’œufs qui est facile à mettre en œuvre et utilise des matériaux facilement disponibles et peu coûteux. Cela comprend la préparation d’une chambre d’imagerie avec une lame et une lamelle de couverture recouverte de ruban d’éthylène propylène fluoré (FEP). La chambre peut être utilisée pour des extraits d’imagerie avec une variété de systèmes de microscopie, y compris des stéréoscopes et des microscopes droits et inversés. Cette méthode ne nécessite aucun traitement chimique des surfaces tout en obtenant une clarté optique similaire obtenue avec les méthodes à base de verre existantes décrites ci-dessus. Il est conçu pour imager une couche d’extraits avec une épaisseur uniforme sur un champ 2D, et peut être facilement étendu pour imager un volume 3D d’extraits. Il est bien adapté à l’imagerie accélérée du comportement cytoplasmique collectif sur un large champ de vision.
Nous avons utilisé des extraits d’œufs arrêtés par interphase pour démontrer notre méthode d’imagerie. La préparation de l’extrait suit le protocole de Deming et Kornbluth19. En bref, les œufs naturellement arrêtés en métaphase de méiose II sont écrasés par une rotation à basse vitesse. Ce spin libère le cytoplasme de l’arrêt méiotique et permet à l’extrait de passer en interphase. Normalement, la cytochalasine B est ajoutée avant le spin d’écrasement pour inhiber la formation de F-actine. Cependant, il peut être omis si la F-actine est souhaitée. Le cycloheximide est également ajouté avant l’essorage de broyage pour empêcher l’extrait interphase d’entrer dans la mitose suivante. Les extraits sont ensuite placés dans les chambres d’imagerie susmentionnées et placés au microscope. Enfin, les images sont enregistrées au fil du temps à des intervalles définis par une caméra connectée au microscope, produisant des séries d’images accélérées qui capturent le comportement dynamique de l’extrait dans un champ 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont apparus comme un puissant système modèle pour les études basées sur l’imagerie de diverses structures subcellulaires 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 et l’organisation cytoplasmique dans son ensemble.<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions J. Kamenz, Y. Chen et W. Y. C. Huang pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 et R35 GM131792) accordées à James E. Ferrell, Jr.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
Referências
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