Medición De La Fuerza Teánica Isométrica Máxima Del Músculo Tibial Anterior En La Rata

Summary

La evaluación de la recuperación del motor sigue siendo la medida del resultado de la referencia en estudios periféricos experimentales del nervio. La medida isométrica de la fuerza tetánica del músculo anterior de tibialis en la rata es una herramienta inestimable para evaluar resultados funcionales después de la reconstrucción de los defectos del nervio ciático. Los métodos y matices se detallan en este artículo.

Abstract

Lesiones traumáticas del nervio dan lugar a pérdida funcional substancial y los defectos segmentarios del nervio hacen necesario a menudo el uso de los injertos autólogos del nervio de la interposición. Debido a su disponibilidad limitada y a la morbosidad asociada del lado dispensador de aceite, muchos estudios en el campo de la regeneración del nervio se centran en técnicas alternativas para cerrar un boquete segmentario del nervio. Para investigar los resultados de las opciones experimentales quirúrgicas o farmacológicas del tratamiento, el modelo del nervio ciático de la rata se utiliza a menudo como prueba biológica. Hay una variedad de medidas de resultado utilizadas en modelos de ratas para determinar el grado de regeneración nerviosa. La fuerza máxima de salida del músculo diana sigue siendo el resultado más relevante para la traducción clínica de terapias experimentales. La medida isométrica de la fuerza de la contracción tetánica del músculo se ha descrito previamente como técnica reproducible y válida para evaluar la recuperación del motor después de lesión o de la reparación del nervio en modelos de la rata y del conejo. En este vídeo, proporcionaremos una instrucción paso a paso de este procedimiento inestimable para el gravamen de la recuperación funcional del músculo anterior de tibialis en un modelo del defecto del nervio ciático de la rata usando parámetros optimizados. Describiremos las preparaciones prequirúrgicas necesarias además del acercamiento y de la disección quirúrgicos del nervio peroneo común y del tendón anterior del músculo tibialis. Se detallará la técnica isométrica de medición de la fuerza tetánica. Se explica la determinación de la longitud óptima del músculo y la frecuencia del pulso del estímulo y se demuestra la medición de la contracción máxima del músculo tetánico.

Introduction

La pérdida de la función motora después de una lesión traumática del nervio periférico tiene un impacto significativo en la calidad de vida y el estado socioeconómico de los pacientes^1,2,3. El pronóstico de esta población de pacientes sigue siendo pobre debido a las mejoras mínimas en las técnicas quirúrgicas a lo largo de los años^4. La reparación epineural directa de extremo a extremo sin tensión forma la reconstrucción quirúrgica estándar de oro. Sin embargo, en los casos con brechas nerviosas extendidas, la interposición de un injerto de nervio autólogo ha demostrado ser superior^5,6. La morbilidad asociada al sitio donante y la disponibilidad limitada de injertos de nervio autólogo han impuesto la necesidad de técnicas alternativas^7,8.

Se han utilizado modelos animales experimentales para dilucidar el mecanismo de regeneración de los nervios periféricos y evaluar los resultados de una variedad de opciones de tratamiento reconstructivo y farmacológico^8,9. El modelo de nervio ciático de rata es el modelo animal más utilizado^10. Su pequeño tamaño los hace fáciles de manejar y casar. Debido a su potencial neurorregenerativo superlativo, la disminución del tiempo entre la intervención y la evaluación de los resultados puede resultar en costos relativamente^{menores 11,12.} Otras ventajas de su uso incluyen similitudes morfológicas con las fibras nerviosas humanas y el alto número de estudios comparativos/históricos^13. Aunque este último debe abordarse con cautela, ya que una amplia variedad de diferentes medidas de resultado entre los estudios hace que sea difícil comparar los resultados^{14,15,16,17,18.}

Las medidas de resultado para evaluar la regeneración nerviosa van desde la electrofisiología hasta la histomorfometría, pero estos métodos implican una correlación pero no necesariamente miden directamente el retorno de la función^{motora 14,15.} La regeneración de las fibras nerviosas podría no hacer conexiones apropiadas que pueden causar una sobreestimación del número de conexiones^{funcionales 14,15,19,20.} La mejor y clínicamente más relevante medida para demostrar la reinnervación correcta de los órganos finales sigue siendo la evaluación de la función muscular^21,22,23. Sin embargo, la creación de herramientas de evaluación de la función motora para modelos animales es un desafío. Medinaceli et al. describieron por primera vez el análisis de la pista de senderismo, que desde entonces ha sido el método más utilizado para evaluar la recuperación funcional en estudios experimentales de nervios periféricos^{21,24,25,26,27,28.} El análisis de la pista de caminar cuantifica el índice funcional ciático (SFI) basado en las mediciones de huellas de patas de ratas caminantes^21,29. Las principales limitaciones del análisis de la pista de caminar, como las contracturas de los dedos de los dedos, la automutilación, el manchado de la impresión y la mala correlación con otras medidas de reinnervación, han requerido el uso de otros parámetros para la cuantificación de la recuperación funcional^30,31.

En estudios previos en ratas Lewis³² y conejos neozelandeses^33,validamos la medición isométrica de la fuerza tetánica (ITF) para el músculo tibial anterior (TA) y demostramos su efectividad en la evaluación de la recuperación muscular después de diferentes tipos de reparación nerviosa^{34,35, 36,37,38,39.} El músculo TA es muy adecuado debido a su tamaño relativamente grande, inervación por la rama peroneal del nervio ciático y propiedades bioquímicas bien dilucidadas^40,41,42,43. Cuando se optimiza la longitud muscular (fuerza de precarga) y los parámetros eléctricos, la ITF proporciona una variabilidad de lado a lado de 4,4% y 7,5% en ratas³² y conejos^33,respectivamente.

Este artículo proporciona un protocolo detallado de la medida de ITF en el modelo del nervio ciático de la rata, incluyendo una descripción cuidadosa del planeamiento prequirúrgico necesario, del acercamiento quirúrgico y de la disección del nervio peroneo común y del tendón distal del músculo de TA. Utilizando valores predeterminados para la intensidad y duración del estímulo, se definirá la longitud muscular óptima y la frecuencia del pulso del estímulo. Con estos cuatro parámetros, la ITF puede medirse posteriormente de manera consistente y precisa.

Protocol

Todos los procedimientos de animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC A334818). 1. Calibración del transductor de fuerza Asegúrese de que el ordenador esté conectado correctamente al dispositivo multifuncional de adquisición de datos de E/S (DAQ) USB-6009, que a su vez debe estar conectado al transductor de fuerza.NOTA: Otras cepas y especies de ratas pueden requerir un transductor de fuerza de célula de carga dif…

Representative Results

Se utilizan cinco parámetros para medir la medición de la ITF. Estos incluyen tensión muscular (fuerza de precarga), intensidad de estímulo (voltaje), frecuencia de pulso de estímulo, duración del estímulo de 0,4 ms y un retraso de 2 ms. Antes de medir la ITF, la tensión muscular óptima debe determinarse utilizando dos contracciones musculares de contracción única a una intensidad de 2 V durante la prueba de parámetros. Estos estímulos provocan la dorsiflexión de la pata y producen una señal de salida en e…

Discussion

Este protocolo describe un método previamente validado para adquirir las medidas máximas exactas de ITF del músculo del TA en el modelo³²de la rata. La recuperación de la fuerza máxima después de los tratamientos experimentales de la reconstrucción del nervio es de interés primario en el ajuste clínico pues prueba que el nervio no sólo regeneró, pero también hizo conexiones de trabajo con el músculo de la blanco. El ITF se puede utilizar en un modelo de brecha nerviosa pequeña, como …

Materials

0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA	G130203
1 mm Kirshner wires	Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ	N/A
Adson Tissue Forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-6801226
Bipolar electrode cables	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Bipolar stimulator device	Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Cotton-tip Applicators	Cardinal Health, Waukegan, IL, USA	C15055-006
Curved Mosquito forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5	Transducer Techniques, Temecula, CA	N/A
Gauze Sponges 4×4	Covidien, Mansfield, MA, USA	2733
Ground cable	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Isoflurane chamber	N/A	N/A	Custom-made
Ketamine	Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ	42023-115-10
LabView Software	National Instruments, Austin, TX
Loop	N/A	N/A	Custom-made
Microsurgical curved forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JFA-5B
Microsurgical scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JF-3
Retractor	ASSI, Westbury, NY, USA	AG-124426
Scalpel Blade No. 15	Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA	371115
Slim Body Skin Stapler	Covidien, Mansfield, MA, USA	8886803512
Subminiature electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	N/A
Surgical Nerve Stimulator	Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA	9094
Terrell Isoflurane	Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA	H961J19A
Testing platform	N/A	N/A	Custom-made
Tetontomy Scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device	National Instruments, Austin, TX	779026-01
Vacuum Base Holder	Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal	N/A	Attached clamp is custom-made
Weight (10 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820010.4
Weight (20 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820020.4
Weight (50 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820050.4
Xylazine	Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada	1XYL002