Maximal isotrisk stelkramp mätning av tibialis främre muskeln hos råtta

Summary

Utvärdering av motorisk återhämtning förblir riktmärket resultatet åtgärd i experimentella perifera nerv studier. Den isometriska stelkramp kraft mätning av tibialis främre muskeln i råtta är ett ovärderligt verktyg för att bedöma funktionella resultat efter återuppbyggnad av ischias nerv defekter. Metoderna och nyanserna beskrivs i den här artikeln.

Abstract

Traumatiska nerv skador resulterar i betydande funktionella förlust och segmental nerv defekter kräver ofta användning av autolog interposition nerv ympkvistar. På grund av deras begränsade tillgänglighet och tillhörande donator sida sjuklighet, många studier inom området nerv regenerering fokuserar på alternativa tekniker för att överbrygga en segmental nerv gap. För att undersöka resultaten av kirurgiska eller farmakologiska experimentella behandlingsalternativ används råtta ischias nerv modell ofta som en bioassay. Det finns en mängd olika utfallsmätningar som används i råttmodeller för att bestämma omfattningen av nervregenerering. Den maximala utdatakraften hos målmuskeln är fortfarande det mest relevanta resultatet för klinisk översättning av experimentella terapier. Isometrisk kraftmätning av stelkramp muskelkontraktion har tidigare beskrivits som en reproducerbar och giltig teknik för att utvärdera motorisk återhämtning efter nervskada eller reparation i både råtta och kanin modeller. I den här videon kommer vi att ge en steg-för-steg-instruktion av detta ovärderliga förfarande för bedömning av funktionell återhämtning av tibialis främre muskeln i en råtta ischias nerv defekt modell med hjälp av optimerade parametrar. Vi kommer att beskriva de nödvändiga pre-kirurgiska preparat utöver kirurgiska tillvägagångssätt och dissekering av gemensamma peroneal nerv och tibialis främre muskel sena. Den isometriska tetaniska kraftmätningstekniken kommer att specificeras. Bestämning av optimal muskellängd och stimulanspulsfrekvens förklaras och mätning av maximal stelkramtisk muskelkontraktion påvisas.

Introduction

Förlust av motorisk funktion efter traumatisk perifera nerv skada har en betydande inverkan på livskvalitet och socioekonomisk status hos patienter^1,2,3. Prognosen för denna patientpopulation är fortfarande dålig på grund av minimala förbättringar i kirurgiska tekniker under åren⁴. Direkt end-to-end spänning-fria epineural reparation bildar guld standard kirurgiska återuppbyggnad. Men i fall med utökade nerv luckor interposition av en autolog nerv moderplantor har visat sig vara överlägsen^5,6. Den tillhörande donator webbplats sjuklighet och begränsad tillgänglighet av autolog nerv ympkvistar har infört behovet av alternativa tekniker^7,8.

Experimentella djurmodeller har använts för att belysa mekanismen för perifer nervregenerering och för att utvärdera resultaten av en mängd rekonstruktiva och farmakologiska behandlingsalternativ^8,9. Råtta ischias nerv modell är den vanligaste djurmodell¹⁰. Deras lilla storlek gör dem lätta att hantera och hysa. På grund av deras superlativa neuroregenerativa potential kan den minskade tiden mellan intervention och utvärdering av resultat resultera i relativt lägre kostnader^11,12. Andra fördelar med dess användning inkluderar morfologiska likheter med mänskliga nervfibrer och det höga antalet jämförande / historiska studier¹³. Även om det senare bör närma sig försiktigt, eftersom en mängd olika utfallsmått mellan studier gör det svårt att jämföra resultat^{14,15,16,17,18}.

Utfallsåtgärder för att bedöma nervregenerering sträcker sig från elektrofysiologi till histomorfologi, men dessa metoder innebär ett samband men mäter inte nödvändigtvis direkt återkomsten av motorisk^{funktion 14,15}. Regenererande nervfibrer kanske inte gör lämpliga anslutningar som kan orsaka en överskattning av antalet funktionella anslutningar^14,15,19,20. Den bästa och kliniskt mest relevanta mätningen för att påvisa korrekt återinsättning av slutorgan förblir bedömning av muskelfunktion^21,22,23. Att skapa motoriska funktionsbedömningsverktyg för djurmodeller är dock utmanande. Medinaceli et al. beskrev först vandringsspåranalysen, som sedan dess har varit den vanligaste metoden för att utvärdera funktionell återhämtning i experimentella perifera^{nervstudier 21,24,25,26,27,28}. Vandringsspåranalysen kvantifierar det ischiasfunktionella indexet (SFI) baserat på mätningar av tassavtryck från gångråttor^21,29. Stora begränsningar av vandringsspåranalysen, såsom tåkontrakturer, automutilation, utstryk av trycket och dålig korrelation med andra åtgärder för återinsättning, har krävt användning av andra parametrar för kvantifiering av funktionell^{återhämtning 30,31}.

I tidigare studier på Lewis råttor³² och Nya Zeeland^{kaniner 33}, validerade vi den isometriska tetaniska kraften (ITF) mätning för tibialis främre (TA) muskeln och visade dess effektivitet i utvärderingen av muskelåterhämtning efter olika typer av nerv reparation^{34,35,36,37,38,39}. TA-muskeln är väl lämpad på grund av dess relativt stora storlek, innervation av den peroneala grenen av ischiasnerven och väl belyser biokemiska egenskaper^40,41,42,43. När muskellängd (förbelastningskraft) och elektriska parametrar optimeras ger ITF en variabilitet från sida till sida på 4,4% respektive 7,5% hos råttor³² respektive^{kaniner 33.}

Denna artikel ger ett detaljerat protokoll av ITF mätning i råtta ischias nerv modell, inklusive en grundlig beskrivning av den nödvändiga pre-surgical planering, kirurgiska tillvägagångssätt och dissekering av den gemensamma peroneal nerv och distala TA muskel sena. Med hjälp av förutbestämda värden för stimulansintensiteten och varaktigheten kommer den optimala muskellängden och stimulanspulsfrekvensen att definieras. Med dessa fyra parametrar kan ITF därefter mätas konsekvent och noggrant.

Protocol

Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A334818). 1. Kalibrering av kraftgivaren Kontrollera att datorn är korrekt ansluten till USB-6009 multifunktionella I/O-datainsamlingsenhet (DAQ), som i sin tur ska anslutas till kraftgivaren.OBS: Andra råttstammar och arter kan kräva en annan lastcellskraftgivare eftersom högre krafter kan förväntas 44. Fäst en anpassad klämma från en modi…

Representative Results

Fem parametrar används för att mäta ITF-mätningen. Dessa inkluderar muskelspänning (förbelastningskraft), stimulansintensitet (spänning), stimulanspulsfrekvens, stimulanstid på 0,4 ms och en fördröjning på 2 ms. Innan ITF mäts måste den optimala muskelspänningen bestämmas med hjälp av två muskelsammandragningar med en intensitet av 2 V under parametertestet. Dessa stimuli orsakar dorsiflexion av tassen och ger en utgångssignal på grafen i VI (Figur 5). Dessa enda ryckkurvo…

Discussion

Detta protokoll beskriver en tidigare validerad metod för att förvärva exakta maximala ITF mätningar av TA muskeln i råtta modell³². Återhämtning av maximal styrka efter experimentella nerv återuppbyggnad behandlingar är av primärt intresse i den kliniska inställningen eftersom det bevisar att nerven inte bara regenereras, men också gjorde fungerande anslutningar med målmuskeln. ITF kan användas i en liten nervgap modell, såsom råtta ischias nerv modell³², o…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA	G130203
1 mm Kirshner wires	Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ	N/A
Adson Tissue Forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-6801226
Bipolar electrode cables	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Bipolar stimulator device	Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Cotton-tip Applicators	Cardinal Health, Waukegan, IL, USA	C15055-006
Curved Mosquito forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5	Transducer Techniques, Temecula, CA	N/A
Gauze Sponges 4×4	Covidien, Mansfield, MA, USA	2733
Ground cable	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Isoflurane chamber	N/A	N/A	Custom-made
Ketamine	Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ	42023-115-10
LabView Software	National Instruments, Austin, TX
Loop	N/A	N/A	Custom-made
Microsurgical curved forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JFA-5B
Microsurgical scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JF-3
Retractor	ASSI, Westbury, NY, USA	AG-124426
Scalpel Blade No. 15	Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA	371115
Slim Body Skin Stapler	Covidien, Mansfield, MA, USA	8886803512
Subminiature electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	N/A
Surgical Nerve Stimulator	Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA	9094
Terrell Isoflurane	Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA	H961J19A
Testing platform	N/A	N/A	Custom-made
Tetontomy Scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device	National Instruments, Austin, TX	779026-01
Vacuum Base Holder	Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal	N/A	Attached clamp is custom-made
Weight (10 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820010.4
Weight (20 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820020.4
Weight (50 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820050.4
Xylazine	Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada	1XYL002