3D תא מודפס סרטן היפוקסי על שבב עבור recapitulating התקדמות פתולוגית של סרטן מוצק
Summary
היפוקסיה היא סימן ההיכר של microenvironment הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתקדמות הסרטן. מאמר זה מתאר את תהליך הייצור של סרטן היפוקסי על שבב המבוסס על טכנולוגיית הדפסת תאים 3D כדי לשחזר פתולוגיה הקשורות היפוקסיה של סרטן.
Abstract
מיקרו-וירוס סרטן יש השפעה משמעותית על התקדמות המחלה. בפרט, היפוקסיה היא המניע העיקרי של הישרדות סרטן, פלישה, ו chemoresistance. למרות מספר מודלים במבחנה פותחו כדי ללמוד פתולוגיה סרטן הקשורות היפוקסיה, יחסי הגומלין המורכבים של microenvironment סרטן שנצפו vivo לא שוחזר עדיין בשל חוסר שליטה מרחבית מדויקת. במקום זאת, גישות biofabrication 3D הוצעו כדי ליצור מערכות מיקרופיזיולוגיות עבור חיקוי טוב יותר של אקולוגיה סרטן והערכה מדויקת טיפול נגד סרטן. בזאת, אנו מציעים גישה של הדפסת תאים בתלת-ממד כדי ליצור סרטן היפוקסי על שבב. הרכיבים מעוררי היפוקסיה בשבב נקבעו על סמך הדמיית מחשב של התפלגות החמצן. טבעות קונצנטריות סרטן סטרומה הודפסו באמצעות bioinks המכילים תאים גליובלסטומה ותאי אנדותל כדי לסכם סוג של סרטן מוצק. השבב וכתוצאה מכך הבין היפוקסיה מרכזית ממאירות בנסיבות מחמירות בסרטן עם היווצרות של סמנים פתופיזיולוגיים מייצגים. בסך הכל, הגישה המוצעת ליצירת מערכת מיקרופיזיולוגית מוצקה-סרטן-מימטית צפויה לגשר על הפער בין מודלים in vivo ו in vitro לחקר הסרטן.
Introduction
microenvironment סרטן הוא גורם קריטי המניע את התקדמות הסרטן. רכיבים מרובים, כולל רמזים ביוכימיים, ביופיזיים ותאית, קובעים את התכונות הפתולוגיות של סרטן. בין אלה, היפוקסיה קשורה קשר הדוק עם הישרדות סרטן, התפשטות, פלישה1. בשל הצמיחה הבלתי מוגבלת וחלוקה של תאים סרטניים, חומרים מזינים וחמצן מתרוקנים ברציפות, שיפוע היפוקסי נוצר. בתנאים של חמצן נמוך, תאים מפעילים גורם שעתוק היפוקסיה-בלתי ניתן להקרבה (HIF) הקשורים מפל מולקולרי. תהליך זה גורם לליבה נמקית, מפעיל שינויים מטבוליים, ויוזם היפרפלזיה של כלי דם וגרורות2,3. לאחר מכן, היפוקסיה בתאים סרטניים גורמת להרס של רקמות נורמליות שכנות. יתר על כן, היפוקסיה קשורה קשר הדוק עם ההתנגדות הטיפולית של גידולים מוצקים בנימוסים רב-גורמיים. היפוקסיה עלולה לעכב קשות הקרנות, כמו רגישות רדיו מוגבלת בשל מינים חמצן תגובתי1,4. בנוסף, זה מקטין את רמות ה- pH של microenvironments סרטן, אשר מקטין הצטברות תרופות1. לכן, שחזור תכונות פתולוגיות הקשורות היפוקסיה במבחנה היא אסטרטגיה מבטיחה עבור ממצאים מדעיים פרה קליניים.
מידול microenvironment מסוים של סרטן חיוני להבנת התפתחות סרטן וחקר טיפולים מתאימים. למרות מודלים בעלי חיים כבר בשימוש נרחב בגלל הרלוונטיות הפיזיולוגית החזקה שלהם, נושאים הקשורים הבדלים מינים ובעיות אתיות קיימים5. יתר על כן, למרות מודלים קונבנציונליים 2D ו 3D לאפשר מניפולציה והדמיה בזמן אמת של תאים סרטניים לניתוח מעמיק, המורכבות האדריכלית והתאית שלהם לא ניתן לשחזר באופן מלא. לדוגמה, מודלים ספירואיד סרטן כבר בשימוש נרחב, כמו צבירת תאים סרטני בספרואיד יכול באופן טבעי ליצור היפוקסיה בליבה. יתר על כן, מספר גדול של ספרואידים סלולריים בגודל אחיד יוצרו באמצעות מערכות מולטי-באר מבוססות פלסטיק או סיליקון6,7. עם זאת, הגמישות הנמוכה יותר לגבי לכידת המבנה ההטרוגני המדויק של רקמות סרטניות עם פלטפורמות קונבנציונליות דרשה הקמת טכנולוגיית biofabrication מתקדמת כדי לבנות פלטפורמה ביומימטית מאוד כדי לשפר את חקר הסרטן8.
מערכות מיקרופיזיולוגיות תלת מימדיות (MPSs) הן כלים שימושיים לסיכום הגיאומטריה המורכבת וההתקדמות הפתולוגית של תאים סרטניים9. כמו תאים סרטניים לחוש את השיפוע הביוכימי של גורמי גדילה וכימוקינים ואת ההטרוגניות המכנית לשכפל על המערכת, תכונות חשובות של התפתחות סרטן ניתן לחקור במבחנה. לדוגמה, כדאיות סרטן, ממאירות גרורתית, עמידות לתרופות בהתאם ריכוזי חמצן משתנים נחקרה באמצעות MPSS10,11. למרות ההתקדמות האחרונה, יצירת תנאים היפוקסיים של מודלים במבחנה מסתמכת על הליכי ייצור מורכבים, כולל חיבור עם משאבות גז פיזיות. לכן, יש צורך בשיטות פשוטות וגמישות לבניית מיקרו-וירוסים ספציפיים לסרטן.
טכנולוגיית הדפסת תאים תלת מימדית זכתה לתשומת לב רבה בגלל השליטה המדויקת שלה בסידור המרחבי של ביו-חומרים לסיכום ארכיטקטורות ביולוגיות מקומיות12. בפרט, טכנולוגיה זו מתגברת על המגבלות הקיימות של מודלים היפוקסיה 3D בשל השליטה הגבוהה שלה ואת ההיתכנות לבניית התכונות המרחביות של microenvironment סרטן. הדפסה תלת-ממדית גם מאפשרת ייצור בעזרת מחשב באמצעות תהליך שכבה אחר שכבה, ובכך מספקת בנייה מהירה, מדויקת וניתן לשחזור של גיאומטריות מורכבות כדי לחקות ארכיטקטורות רקמות בפועל. בנוסף ליתרונות של אסטרטגיות ייצור קיימות עבור MPSs 3D, התכונות הפתופיזיולוגיות של התקדמות סרטן ניתן לשחזר על ידי דפוס הרכיבים הביוכימיים, הסלולר, וביופיזי13,14.
בזאת, אנו מציגים אסטרטגיית הדפסת תאים תלת-ממדית עבור סרטן היפוקסי על שבב לסיכום ההטרוגניות של סרטן מוצק (איור 1)15. פרמטרי הייצור נקבעו באמצעות סימולציה חישובית של היווצרות היפוקסיה מרכזית במערכת. טבעות קונצנטריות סרטן סטרומה הודפסו באמצעות bioinks קולגן המכילים תאים גליובלסטומה ותאי אנדותל לחקות את הפתופיזיולוגיה של גליובלסטומה, סוג של סרטן מוצק. היווצרות של שיפוע חמצן רדיאלי מחמירות ממאירות סרטן, המציין תוקפנות מחוזקת. יתר על כן, אנו מציינים פרספקטיבות עתידיות עבור היישומים של השבב למודלים פרה-קוליניים ספציפיים למטופל. הגישה המוצעת ליצירת מערכת מיקרופיזיולוגית מוצקה-סרטן-מימטית צפויה לגשר על הפער בין מודלים in vivo ו במבחנה של סרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מתארים את תהליך הייצור של סרטן היפוקסי על שבב המבוסס על טכנולוגיית הדפסת תאים 3D. היווצרות השיפוע ההיפוקסי בשבב המתוכנן נצפתה באמצעות הדמיות מחשב. הסביבה שיכולה לגרום לשיפוע היפוקסי הטרוגני שוחזרה באמצעות אסטרטגיה פשוטה המשלבת את מחסום חדיר הגז המודפס בתלת-ממד ואת כיסוי הזכו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (מס ‘ 2020R1A6A1A03047902 ו- NRF-2018H1A2A1062091) וממשלת קוריאה (MSIT) (לא. NRF-2019R1C1C1009606 ו- NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
Referências
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengenharia. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
