3D-cellstryckt hypoxisk cancer-på-ett-chip för rekapitlatering av patologisk progression av fast cancer
Summary
Hypoxi är ett kännetecken för tumörmikromiljö och spelar en avgörande roll i cancerprogressionen. Denna artikel beskriver tillverkningsprocessen av en hypoxic cancer-på-ett-chip baserat på 3D cell-utskrift teknik att rekapitulera en hypoxi-relaterade patologi av cancer.
Abstract
Mikromiljön för cancer har en betydande inverkan på sjukdomsförloppet. I synnerhet är hypoxi den viktigaste drivkraften för canceröverlevnad, invasion och chemoresistance. Även om flera in vitro-modeller har utvecklats för att studera hypoxirelaterad cancerpatologi, har det komplexa samspelet mellan den cancermikromiljö som observerats in vivo ännu inte reproducerats på grund av bristen på exakt rumslig kontroll. I stället har 3D-biofabriceringsmetoder föreslagits för att skapa mikrofysiologiska system för bättre emulering av cancerekologi och noggrann utvärdering av cancerbehandling. Häri föreslår vi en 3D-cellutskriftsmetod för att tillverka en hypoxisk cancer-på-ett-chip. Hypoxiframkallande komponenter i chipet fastställdes baserat på en datorsimulering av syrefördelningen. Cancer-stroma koncentriska ringar trycktes med hjälp av bioinks som innehåller glioblastom celler och endotelceller att rekapitulera en typ av fast cancer. Det resulterande chipet realiserade centrala hypoxi och förvärrad malignitet i cancer med bildandet av representativa patofysiologiska markörer. Sammantaget förväntas det föreslagna tillvägagångssättet för att skapa ett system med fast cancer-mimetisk mikrofysiologisk strategi överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller för cancerforskning.
Introduction
Cancermikromiljön är en kritisk faktor som driver cancerprogressionen. Flera komponenter, inklusive biokemiska, biofysiska och cellulära signaler, bestämmer de patologiska egenskaperna hos cancer. Bland dessa är hypoxi starkt förknippad med canceröverlevnad, spridning och invasion1. På grund av obegränsad tillväxt och uppdelning av cancerceller utarmas näringsämnen och syre kontinuerligt, och en hypoxisk gradient genereras. Under förhållanden med låg syrehalt aktiverar cellerna hypoxi-inducerbar transkriptionsfaktor (HIF)-associerad molekylär kaskad. Denna process inducerar en nekrotisk kärna, utlöser metaboliska förändringar och initierar blodkärlshyperplasi och metastasering2,3. Därefter orsakar hypoxi i cancerceller förstörelsen av närliggande normala vävnader. Hypoxi är dessutom starkt förknippat med terapeutisk resistens hos solida tumörer på multifaktoriellt sätt. Hypoxi kan allvarligt hämma strålbehandling, eftersom radiokänsligheten är begränsad på grund av reaktiva syrearter1,4. Dessutom minskar det pH-nivåerna av cancermikromiljö, vilket minskar läkemedelsackumuleringen1. Därför är reproducerning patologiska funktioner relaterade till hypoxi in vitro en lovande strategi för vetenskapliga och prekliniska resultat.
Modellering av en specifik mikromiljö av cancer är avgörande för att förstå cancerutveckling och utforska lämpliga behandlingar. Även om djurmodeller har använts i stor utsträckning på grund av deras starka fysiologiska relevans, finns det problem relaterade till artskillnader och etiska problem5. Även om konventionella 2D- och 3D-modeller möjliggör manipulering och realtidsavbildning av cancerceller för en djupgående analys, kan deras arkitektoniska och cellulära komplexitet inte helt rekapituleras. Till exempel har cancersfäroidmodeller använts i stor utsträckning, eftersom cancercellsaggregering i en sfäroid naturligt kan generera hypoxi i kärnan. Dessutom har ett stort antal cellulära sfäroider av enhetlig storlek producerats med hjälp av plast- eller silikonbaserade multibrunnssystem6,7. Den lägre flexibiliteten när det gäller att fånga den exakta heterogena strukturen hos cancervävnader med konventionella plattformar har dock krävt inrättandet av en avancerad biofabriceringsteknik för att bygga en mycket biomimetisk plattform för att förbättracancerforskningen 8.
3D-mikrofysiologiska system (MPS) är användbara verktyg för att rekapitulera den komplexa geometrin och patologiska progressionen av cancerceller9. Eftersom cancerceller känner av den biokemiska lutningen av tillväxtfaktorer och kemokiner och den mekaniska heterogenitet som reproduceras i systemet, kan viktiga egenskaper hos cancerutveckling undersökas in vitro. Till exempel har cancer livskraft, metastaserad malignitet och läkemedelsresistens beroende på de varierande syrekoncentrationerna studerats med hjälp av MPSs10,11. Trots de senaste framstegen, genererar hypoxiska förhållanden för in vitro-modeller förlitar sig på komplexa tillverkningsförfaranden, inklusive anslutning till fysiska gaspumpar. Därför behövs enkla och flexibla metoder för att bygga cancerspecifika mikromiljöer.
3D-celltrycksteknik har fått stor uppmärksamhet på grund av dess exakta kontroll av biomaterialens rumsliga arrangemang för att rekapitulera inhemska biologiska arkitekturer12. I synnerhet övervinner denna teknik de befintliga begränsningarna hos 3D-hypoximodeller på grund av dess höga kontrollerbarhet och genomförbarhet för att bygga upp de rumsliga egenskaperna hos cancermikromiljön. 3D-utskrift underlättar också datorstödd tillverkning genom en lager-för-lager-process, vilket ger en snabb, exakt och reproducerbar konstruktion av komplexa geometrier för att efterlikna faktiska vävnadsarkitekturer. Förutom fördelarna med befintliga tillverkningsstrategier för 3D MPSs kan de patofysiologiska egenskaperna hos cancerprogression reproduceras genom att mönstra de biokemiska, cellulära och biofysiskakomponenterna 13,14.
Häri presenterar vi en 3D-celltrycksstrategi för en hypoxisk cancer-på-ett-chip för att rekapitituera heterogeniteten hos en fast cancer (Figur 1)15. Tillverkningsparametrarna fastställdes via en beräkningssimulering av centrala hypoxi bildas i systemet. Cancer-stroma koncentriska ringar trycktes med kollagen bioinks som innehåller glioblastoma celler och endotel celler att efterlikna patofysiologi av glioblastom, en typ av fast cancer. Bildandet av en radiell syregradient förvärrade cancer malignitet, vilket indikerar förstärkt aggressivitet. Vidare anger vi framtida perspektiv för chipens tillämpningar på patientspecifika prekliniska modeller. Det föreslagna tillvägagångssättet för att skapa ett system med fast cancer-mimetisk mikrofysiologiskt system förväntas överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller av cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie beskriver vi tillverkningsprocessen för en hypoxisk cancer-på-ett-chip baserad på 3D-celltrycksteknik. Bildandet av hypoxic gradienten i det utformade chipet förutspåddes genom datorsimuleringar. Miljön som kan inducera en heterogen hypoxic gradient reproducerades via en enkel strategi som kombinerar den 3D-printade gas-permeable barriären och glas locket. Hypoxi-relaterade patologiska funktioner i glioblastom, inklusive pseudopalisade och en liten population av cancer stamceller, recapitulated unde…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) som finansierades av utbildningsministeriet (nr 2020R1A6A1A03047902 och NRF-2018H1A2A1062091) och Koreas regering (MSIT) (nr. NRF-2019R1C1C1009606 och NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
Referências
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengenharia. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
