Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri

Summary

De eksperimentelle procedurer for udførelse af diethylpyrocarbonatbaseret kovalent mærkning med massespektrometrisk detektion er beskrevet. Diethylpyrocarbonat blandes simpelthen med det protein- eller proteinkompleks af interesse, hvilket fører til modifikation af opløsningsmiddeltilgængelige aminosyrerester. De modificerede restkoncentrationer kan identificeres efter proteolytisk fordøjelse og analyse af flydende kromatografi/massespektrometri.

Abstract

Karakterisere et protein’s højere orden struktur er afgørende for at forstå dens funktion. Massespektrometri (MS) har vist sig at være et effektivt værktøj til dette formål, især for proteinsystemer, der er vanskelige at studere efter traditionelle metoder. For at studere et proteins struktur ved MS udføres specifikke kemiske reaktioner i opløsning, der koder et proteins strukturelle oplysninger i dets masse. En særlig effektiv tilgang er at anvende reagenser, der kovalent ændrer opløsningsmiddeltilgængelige aminosyrekæder. Disse reaktioner fører til masseforøgelser, der kan lokaliseres med opløsning på restniveau, når de kombineres med proteolytisk fordøjelse og tandemmassespektrometri. Her beskriver vi de protokoller, der er forbundet med brug af diethylpyrocarbonat (DEPC) som et kovalent mærkningsreagens sammen med MS-detektion. DEPC er et meget elektrofilt molekyle, der er i stand til at mærke op til 30% af resterne i det gennemsnitlige protein og derved give fremragende strukturel opløsning. DEPC er med succes blevet anvendt sammen med medlemsstaterne til at indhente strukturelle oplysninger om små enkeltdomæneproteiner, såsom β2-mikroglobulin, til store multidomæneproteiner, såsom monoklonale antistoffer.

Introduction

Proteiner er essentielle biomolekyler i stort set alle fysiologiske processer. De mange forskellige funktioner, som proteiner udfører, er mulige på grund af de strukturer, de vedtager, og de interaktioner, de har med andre biomolekyler. For at forstå proteinfunktionen på et dybere niveau er biokemiske og biofysiske værktøjer nødvendige for at belyse disse vigtige strukturelle træk og interaktioner. Traditionelt har røntgenkrystallografi, kryogen elektronmikroskopi og nuklear magnetisk resonansspektroskopi (NMR) givet den ønskede detaljeringsgrad på atomniveau for at afsløre proteinstrukturen. Men, talrige protein-systemer kan ikke afhøres af disse teknikker på grund af dårlig krystallisering adfærd, begrænset protein tilgængelighed, overdreven prøve heterogenitet, eller molekylær vægt begrænsninger. Derfor er der opstået nyere analysemetoder, der overvinder disse begrænsninger. Blandt de nye teknikker, der kan give protein strukturelle oplysninger er massespektrometri.

Massespektrometri (MS) måler et molekyles masse-til-ladning (m/z) forhold, så protein højere orden strukturelle oplysninger skal opnås ved kodning de ønskede strukturelle oplysninger i massen af proteinet. Der er udviklet flere metoder til indkode disse oplysninger, herunder udveksling af hydrogendeuterium (HDX)^1,2^,3,4, kemisk krydsning (XL)^5,6og kovalent mærkning (CL)^7,8,9,10. I HDX udveksles rygrad midt i brinter af lidt mere massive deuterier til priser, der afhænger af tilgængeligheden af opløsningsmidler og H-bindingsgraden. Omfanget af HDX kan lokaliseres ved hurtigt at fordøje proteinet i peptidfragmenter, før disse fragmenter adskilles og måles ved massespektrometeret eller ved at adskille proteinet i et top-down-eksperiment. Fastsættelsen af valutakursen giver yderligere indsigt i proteindynamik. HDX har vist sig at være et værdifuldt værktøj til at karakterisere proteinstruktur på trods af udfordringer forbundet med rygudveksling og behovet for specialiseret udstyr for at maksimere reproducerbarheden. I XL-MS reageres proteiner med bifunktionelle reagenser, der kovalent forbinder tilstødende restsidekæder med et givet protein eller mellem to proteiner. Dermed kan XL-MS give afstandsbegrænsninger, der kan bruges til at karakterisere proteinstrukturen. De regioner af proteinet, der er krydsbundet, kan identificeres ved proteolytisk fordøjelse efterfulgt af væskekromatografi (LC)-MS-analyse. Mens XL-MS er et alsidigt værktøj, der er blevet brugt til at studere en række proteinkomplekser, herunder inde i celler, er identifikation af XL-produkterne udfordrende og kræver specialiseret software.

CL-MS har for nylig vist sig som et supplerende og undertiden alternativt MS-baseret værktøj til at studere proteinstruktur og interaktioner. I CL-MS modificeres et protein- eller proteinkompleks kovalent med et monofunktionelt reagens, der kan reagere med opløsningsmiddeludsatte sidekæder (Figur 1). Ved at sammenligne modifikationsudvidelserne af et protein- eller proteinkompleks under forskellige forhold kan kropsbygningsændringer, bindingssteder og proteinproteingrænseflader afsløres. Efter CL-reaktionen kan stedsspecifikke oplysninger, ofte på enkelt aminosyreniveau, opnås ved hjælp af typiske bottom-up proteomics-arbejdsgange, hvor proteiner fordøjes proteolytisk, peptidfragmenter adskilles af LC, og modificerede steder identificeres ved hjælp af tandem MS (MS / MS). Den rige historie biokonjugat kemi har gjort mange reagenser til rådighed for CL-MS eksperimenter. CL-reagenser kan inddeles i to generelle kategorier: i) specifikke og ii) ikke-specifikke. Specifikke reagenser reagerer med en enkelt funktionel gruppe (f.eks. frie aminer)^8,10 og er lette at implementere, men de har tendens til at give begrænsede strukturelle oplysninger. Ikke-specifikke reagenser reagerer med en bred vifte af sidekæder, men kræver ofte specialiseret udstyr såsom lasere eller synkrotronkilder til at producere disse meget reaktive arter. Hydroxylradikaler er de mest almindeligt anvendte ikke-specifikke reagenser, der er anvendt i hydroxylradikale fodaftryk (HRF)^7,11,12,13 forsøg med at studere en bred vifte af proteiner og proteinkomplekser under forskellige forhold.

Vores forskningsgruppe har med succes brugt en anden relativt ikke-specifik reagens kaldet diethylpyrocarbonat (DEPC) til at studere proteinstruktur og interaktioner i forbindelse med CL-MS-eksperimenter^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}. DEPC tilbyder enkelheden af specifikke mærkningsreagenser (dvs. intet specialiseret udstyr er nødvendigt for at udføre reaktionerne), mens det reagerer med op til 30% af aminosyrer i det gennemsnitlige protein. Som et meget elektrofilt reagens er DEPC i stand til at reagere med N-endestationen og de nukleofile sidekæder af cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin og threoninerester. Typisk genereres et enkelt produkt af disse reaktioner, hvilket resulterer i en masseforøgelse på 72,02 Da. Denne enkelt type produkt står i kontrast til de op til 55 forskellige produkter, der kan produceres, når proteiner reagerer med hydroxylradikaler⁷. En sådan simpel kemi letter identifikationen af mærkede steder.

Her leverer vi protokoller til brug af DEPC-baseret CL-MS til at studere proteinstruktur og interaktioner. Detaljer i forbindelse med reagenspræparat, DEPC-proteinreaktioner, protein fordøjelsesforhold, LC-MS og MS / MS parametre, og dataanalyse er beskrevet. Vi demonstrerer også nytten af DEPC-mærkning ved at give eksempelresultater fra protein-metal, protein-ligand og proteinproteininteraktioner samt proteiner, der gennemgår strukturelle ændringer ved opvarmning.

Protocol

1. Protein og reagenspræparat BEMÆRK: Denne protokol indeholder et eksempel på en arbejdsgang til mærkning af et protein med DEPC. Nogle af de anførte betingelser og reagenskoncentrationer kan variere afhængigt af det valgte protein. Forbered alle reagensopløsninger i 1,5 mL mikrocentrifugerør. Der fremstilles en proteinopløsning med den ønskede koncentration, normalt i intervallet μM, i en 10 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyrebuffer (MOPS) ved pH 7.4. Alternati…

Representative Results

Identifikation af DEPC-ændringssteder og ændringsprocenterMassetilsætning på grund af kovalent mærkning kan måles ved (a) intakt protein og (b) peptidniveauer8,9. På intakt niveau kan der opnås en fordeling af proteinarter med forskellige antal etiketter fra direkte analyse eller LC-MS af mærkede proteinprøver. For at opnå strukturelle oplysninger med højere opløsning (dvs. stedspecifikke mærkningsdata) skal målingerne udføres på pep…

Discussion

Kritiske trin
Flere punkter vedrørende eksperimentelt design bør overvejes for at sikre pålidelige mærkningsresultater. For det første er det for at maksimere proteinmærkning nødvendigt at undgå buffere med stærkt nukleofile grupper (f.eks. Tris), fordi de kan reagere med DEPC og sænke omfanget af mærkning. Det er også tænkeligt, at sådanne buffere kan reagere med mærkede restkoncentrationer, hvilket medfører fjernelse af etiketten og dermed tab af strukturelle oplysninger. Vi anbefaler MOPS s…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Millipore Sigma	M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-1
Diethylpyrocarbonate	Millipore Sigma	D5758
HPLC-grade water	Fisher Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immobilized chymotrypsin	ProteoChem	g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated	Thermo Fisher Scientific	20230
Iodoacetamide	Millipore Sigma	I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine	Millipore Sigma	C4706