Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

Summary

De eksperimentelle prosedyrene for å utføre dietylpyrokarbonatbasert kovalentmerking med massespektrometrisk deteksjon er beskrevet. Diethylpyrokarbonat blandes ganske enkelt med protein- eller proteinkomplekset av interesse, noe som fører til modifikasjon av løsningsmiddel tilgjengelige aminosyrerester. De modifiserte rester kan identifiseres etter proteolytisk fordøyelse og flytende kromatografi / massespektrometrianalyse.

Abstract

Karakterisering av proteinets høyere ordens struktur er avgjørende for å forstå funksjonen. Massespektrometri (MS) har dukket opp som et kraftig verktøy for dette formålet, spesielt for proteinsystemer som er vanskelige å studere ved tradisjonelle metoder. For å studere et proteins struktur ved MS, utføres spesifikke kjemiske reaksjoner i løsning som koder et proteins strukturelle informasjon inn i massen. En spesielt effektiv tilnærming er å bruke reagenser som kovalent modifiserer løsningsmiddeltilgjengelige aminosyresidekjeder. Disse reaksjonene fører til masseøkninger som kan lokaliseres med oppløsning på restnivå når de kombineres med proteolytisk fordøyelse og tandemmassespektrometri. Her beskriver vi protokollene knyttet til bruk av dietylpyrokarbonat (DEPC) som et kovalent merkingsreagens sammen med MS-deteksjon. DEPC er et svært elektrofilt molekyl som er i stand til å merke opptil 30% av rester i det gjennomsnittlige proteinet, og gir dermed utmerket strukturell oppløsning. DEPC har blitt brukt sammen med MS for å få strukturell informasjon for små enkeltdomeneproteiner, for eksempel β2-mikroglobulin, til store multidomenproteiner, for eksempel monoklonale antistoffer.

Introduction

Proteiner er essensielle biomolekyler i nesten alle fysiologiske prosesser. Mangfoldet av funksjoner som proteiner utfører er mulig på grunn av strukturene de vedtar og interaksjonene de har med andre biomolekyler. For å forstå proteinfunksjonen på et dypere nivå er det nødvendig med biokjemiske og biofysiske verktøy for å belyse disse viktige strukturelle egenskapene og interaksjonene. Tradisjonelt har røntgenkrystallografi, kryogen elektronmikroskopi og kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi gitt ønsket atomnivådetaljer for å avsløre proteinstruktur. Imidlertid kan mange proteinsystemer ikke forhøres av disse teknikkene på grunn av dårlig krystalliseringsadferd, begrenset proteintilgjengelighet, overdreven prøve heterogenitet eller molekylvektbegrensninger. Følgelig har det oppstått nyere analysemetoder som overvinner disse begrensningene. Blant de fremvoksende teknikkene som kan gi proteinstrukturinformasjon er massespektrometri.

Massespektrometri (MS) måler et molekyls masse-til-lading (m / z) forhold, så protein høyere orden strukturell informasjon må oppnås ved å kode ønsket strukturell informasjon inn i massen av proteinet. Flere tilnærminger for å kode denne informasjonen er utviklet, inkludert hydrogen-deuterium utveksling (HDX)^1,2,3,4, kjemisk krysskobling (XL)^5,6og kovalente merking (CL)^7,8,9,10. I HDX utveksles ryggraden blant hydrogener av litt mer massive deuterier til priser som er avhengige av løsningsmiddeltilgjengelighet og H-bindingsutbredelse. Omfanget av HDX kan lokaliseres ved raskt å fordøye proteinet i peptidfragmenter før du skiller og måler disse fragmentene av massespektrometeret eller ved å dissosiere proteinet i et ovenfra og ned-eksperiment. Å bestemme valutakursen gir ytterligere innsikt i proteindynamikk. HDX har vist seg å være et verdifullt verktøy for å karakterisere proteinstruktur til tross for utfordringer knyttet til ryggutveksling og behovet for spesialisert utstyr for å maksimere reproduserbarheten. I XL-MS reageres proteiner med bifunksjonelle reagenser som kovalent forbinder tilstøtende rester av sidekjeder i et gitt protein eller mellom to proteiner. Ved å gjøre dette kan XL-MS gi avstandsbegrensninger som kan brukes til å karakterisere proteinstruktur. Områdene av proteinet som er kryssbundet kan identifiseres ved proteolytisk fordøyelse etterfulgt av flytende kromatografi (LC)-MS-analyse. Mens XL-MS er et allsidig verktøy som har blitt brukt til å studere en rekke proteinkomplekser, inkludert inneceller, er identifisering av XL-produktene utfordrende og krever spesialisert programvare.

CL-MS har nylig dukket opp som et komplementært og noen ganger alternativt MS-basert verktøy for å studere proteinstruktur og interaksjoner. I CL-MS er et protein- eller proteinkompleks kovalent modifisert med et monofunksjonelt reagens som kan reagere med løsningsmiddelutsatte sidekjeder (figur 1). Ved å sammenligne modifikasjonsutbredelsene til et protein- eller proteinkompleks under forskjellige forhold, kan konformasjonsendringer, bindingssteder og proteinproteingrensesnitt avsløres. Etter CL-reaksjonen kan stedsspesifikk informasjon, ofte på enkelt aminosyrenivå, oppnås ved hjelp av typiske proteomiske arbeidsflyter for bunn opp der proteiner fordøyes proteolytisk, peptidfragmenter skilles av LC, og modifiserte steder identifiseres ved hjelp av tandem MS (MS / MS). Den rike historien om biokonjugatkjemi har gjort mange reagenser tilgjengelige for CL-MS-eksperimenter. CL-reagenser faller inn i to generelle kategorier: (i) spesifikke og (ii) ikke-spesifikke. Spesifikke reagenser reagerer med en enkelt funksjonell gruppe (f.eks. frie aminer)^8,10 og er enkle å implementere, men de har en tendens til å gi begrenset strukturell informasjon. Ikke-spesifikke reagenser reagerer med et bredt spekter av sidekjeder, men krever ofte spesialisert utstyr som lasere eller synkrotronkilder for å produsere disse svært reaktive artene. Hydroksylradikaler er det mest brukte ikke-spesifikke reagenset, etter å ha blitt brukt i hydroksylradikale fotavtrykk (HRF)^7,11,12,13 eksperimenter for å studere et bredt spekter av proteiner og proteinkomplekser under en rekke forhold.

Vår forskningsgruppe har vellykket brukt en annen relativt ikke-spesifikk reagens kalt diethylpyrokarbonat (DEPC) for å studere proteinstruktur og interaksjoner i sammenheng med CL-MS-eksperimenter^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}. DEPC tilbyr enkelheten til spesifikke merkingsreagenser (dvs. ingen spesialisert utstyr er nødvendig for å utføre reaksjonene), mens du reagerer med opptil 30% av aminosyrene i det gjennomsnittlige proteinet. Som et svært elektrofilt reagens er DEPC i stand til å reagere med N-terminus og nukleofile sidekjeder av cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin og treoninrester. Vanligvis genereres et enkelt produkt av disse reaksjonene, noe som resulterer i en masseøkning på 72,02 Da. Denne enkle typen produkt står i kontrast til de opptil 55 forskjellige produktene som kan produseres når proteiner reagerer med hydroksylradikaler⁷. Slik enkel kjemi letter identifisering av merkede steder.

Her tilbyr vi protokoller for bruk av DEPC-basert CL-MS for å studere proteinstruktur og interaksjoner. Detaljer knyttet til reagenspreparat, DEPC-proteinreaksjoner, protein fordøyelsestilstander, LC-MS og MS / MS parametere, og dataanalyse er beskrevet. Vi demonstrerer også nytten av DEPC-merking ved å gi eksempelresultater fra proteinmetall-, protein-ligand- og proteinproteininteraksjoner samt proteiner som gjennomgår strukturelle endringer ved oppvarming.

Protocol

1. Protein- og reagenspreparat MERK: Denne protokollen inneholder et eksempel på en arbeidsflyt for merking av et protein med DEPC. Noen forhold og reagenskonsentrasjoner som er oppført, kan variere avhengig av hvor mange typer valg. Forbered alle reagensløsninger i 1,5 ml mikrosenterrør. Forbered en proteinløsning av ønsket konsentrasjon, vanligvis i området titalls μM, i en 10 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS) buffer ved pH 7,4. Alternativt kan du klargj?…

Representative Results

Identifisere depc-endringsområder og endringsprosenterMassetilsetning på grunn av kovalente merking kan måles ved (a) intakt protein og (b) peptidnivåer8,9. På intakt nivå kan en fordeling av proteinarter med forskjellig antall etiketter fås fra direkte analyse eller LC-MS av merkede proteinprøver. For å få strukturell informasjon med høyere oppløsning (dvs. stedsspesifikke merkingsdata), må det utføres målinger på peptidnivå. Etter …

Discussion

Kritiske trinn
Flere punkter om eksperimentell design bør vurderes for å sikre pålitelige merkingsresultater. For det første, for å maksimere proteinmerking, er det nødvendig å unngå buffere med sterkt nukleofile grupper (f.eks. Tris) fordi de kan reagere med DEPC og redusere omfanget av merking. Det kan også tenkes at slike buffere kan reagere med merkede rester, noe som forårsaker fjerning av etiketten og dermed tap av strukturell informasjon. Vi anbefaler MOPS som buffer, men fosfatbufret saltvan…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Millipore Sigma	M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-1
Diethylpyrocarbonate	Millipore Sigma	D5758
HPLC-grade water	Fisher Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immobilized chymotrypsin	ProteoChem	g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated	Thermo Fisher Scientific	20230
Iodoacetamide	Millipore Sigma	I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine	Millipore Sigma	C4706