Генетическая модификация первичных пигментных эпителиальных клеток человека на основе электропорации с использованием транспозонной системы «Спящая красавица»

Summary

Мы разработали протокол для трансфекции первичных пигментных эпителиальных клеток человека путем электропорации с геном, кодирующим фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Успешная трансфекция была продемонстрирована количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), иммуноблоттингом и иммуноферментным анализом (ИФА).

Abstract

Наше все более стареющее общество приводит к росту заболеваемости нейродегенеративными заболеваниями. До сих пор патологические механизмы недостаточно изучены, что препятствует установлению определенных методов лечения. Клеточная аддитивная генная терапия для повышения экспрессии защитного фактора рассматривается как перспективный вариант лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Мы разработали метод стабильной экспрессии гена, кодирующего пигментный эпителий-производный фактор (PEDF), который характеризуется как нейропротекторный и антиангиогенный белок в нервной системе, в геном первичных пигментных эпителиальных (PE) клеток человека с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Первичные ПЭ-клетки были выделены из глаз донора человека и сохранены в культуре. После достижения слияния 1 х 10⁴ клетки суспендировали в 11 мкл буфера ресуспензии и соединяли с 2 мкл очищенного раствора, содержащего 30 нг гиперактивной плазмиды транспозазы SB (SB100X) и 470 нг транспозонной плазмиды PEDF . Генетическую модификацию проводили с помощью капиллярной электропорационной системы с использованием следующих параметров: два импульса напряжением 1 100 В и шириной 20 мс. Трансфектированные клетки переносили в культуральные пластины, содержащие среду, дополненную фетальной бычьей сывороткой; антибиотики и антимикотики добавляли с первым средним обменом. Успешная трансфекция была продемонстрирована в самостоятельно проведенных экспериментах. Количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) показала повышенную экспрессию трансгена PEDF . Секреция PEDF была значительно повышена и оставалась стабильной, что оценивалось иммуноблоттингом и количественно оценивалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). SB100X-опосредованный перенос позволил обеспечить стабильную интеграцию гена PEDF в геном клеток PE и обеспечил непрерывную секрецию PEDF, что имеет решающее значение для разработки клеточной генной аддитивной терапии для лечения ВМД или других дегенеративных заболеваний сетчатки. Более того, анализ профиля интеграции транспозона PEDF в клетки PE человека показал почти случайное геномное распределение.

Introduction

Пожилой возраст описывается как основной риск нейродегенеративных заболеваний. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное заболевание, приводящее к тяжелой потере зрения у пациентов старше 60 лет, относится к четырем наиболее распространенным причинам слепоты и нарушения зрения¹ и, как ожидается, увеличится до 288 миллионов человек в 2040^{году 2}. Дисфункции пигментного эпителия сетчатки (RPE), одного слоя плотно упакованных клеток, расположенных между хориокапиллярами и фоторецепторами сетчатки, способствуют патогенезу ВМД. RPE выполняет множество задач, которые необходимы для нормальной функции сетчатки³ , и выделяет различные факторы роста и факторы, необходимые для поддержания структурной целостности сетчатки и хориокапилляра, тем самым поддерживая выживание фоторецепторов и обеспечивая основу для циркуляции и снабжения питательными веществами.

В здоровых глазах фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), отвечает за балансировку эффектов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и защищает нейроны от апоптоза, предотвращает пролиферацию эндотелиальных клеток и стабилизирует капиллярный эндотелий. Смещенное отношение VEGF к PEDF связано с глазной неоваскуляризацией, которая наблюдалась на животных моделях ^4,5, а также в образцах пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) из-за ВМД и пролиферативной диабетической ретинопатии ^6,7,8,9,10 . Повышенная концентрация VEGF является мишенью для текущего стандартного лечения. Анти-VEGF фармацевтические препараты бевацизумаб, ранибизумаб, афлиберцепт и, совсем недавно, бролуцизумаб улучшают остроту зрения примерно у одной трети пациентов с ХНВ или, скорее, стабилизируют зрение в 90% случаев 11,12,13. Однако частые, часто ежемесячные, интравитреальные инъекции несут риск нежелательных явлений¹⁴, ухудшают соблюдение пациентами и представляют собой значительную экономическую нагрузку для систем здравоохранения¹⁵. Более того, определенный процент пациентов (2%-20%) не реагируют или только плохо реагируют на анти-VEGF терапию 16,17,18,19. Эти негативные сопутствующие факторы требуют разработки альтернативных методов лечения, например, внутриглазных имплантатов, клеточных и/или генных терапевтических подходов.

Генная терапия эволюционировала как перспективное лечение наследственных и ненаследственных заболеваний и направлена на восстановление нефункциональных последовательностей генов или подавление неисправных. Для полигенных заболеваний, где выявление и замена причинных факторов вряд ли возможны, стратегии направлены на непрерывную доставку защитного фактора. В случае ВМД были разработаны различные аддитивные методы лечения, такие как стабильная экспрессия эндостатина и ангиостатина²⁰, антагонист VEGF растворимый fms-подобная тирозинкиназа-1 (sFLT-1)^21,22, регуляторный белковый кластер комплемента дифференцировки 59 (CD59)²³ или PEDF^24,25 . Глаз, и особенно сетчатка, является отличной мишенью для генного лекарства из-за закрытой структуры, хорошей доступности, небольшого размера и иммунной привилегии, что позволяет локализовать доставку низких терапевтических доз и делает трансплантацию менее восприимчивой к отторжению. Кроме того, глаз обеспечивает неинвазивный мониторинг, а сетчатка может быть исследована различными методами визуализации.

Вирусные векторы, благодаря своей высокой эффективности трансдукции, являются основным средством доставки терапевтических генов в клетки-мишени. Однако, в зависимости от используемого вирусного вектора, были описаны различные побочные реакции, такие как иммунные и воспалительные реакции²⁶, мутагенные и онкогенные эффекты ^27,28 или распространение в других тканях²⁹. Практические ограничения включают ограниченный размер упаковки³⁰, а также трудности и затраты, связанные с производством партий клинического сорта^31,32. Эти недостатки способствовали дальнейшему развитию невирусных, основанных на плазмидах векторов, которые передаются через липо-/полиплексы, ультразвук или электропорацию. Однако геномная интеграция трансгена в геном хозяина обычно не стимулируется плазмидными векторами, что приводит к переходной экспрессии.

Транспозоны — это естественные фрагменты ДНК, которые изменяют свое положение в геноме, характеристика, которая была принята для генной терапии. Благодаря активному механизму интеграции векторные системы на основе транспозонов позволяют непрерывно и постоянно выражать вставленный трансген. Транспозон Спящей красавицы (SB), восстановленный из древнего транспозона типа Tc1/mariner, обнаруженного у рыб³³ и дополнительно улучшенного молекулярной эволюцией, что привело к гиперактивному варианту SB100X³⁴, обеспечил эффективную транспозицию в различных первичных клетках и использовался для фенотипической коррекции в различных моделях заболеваний³⁵. В настоящее время начато 13 клинических испытаний с использованием транспозонной системы SB . Транспозонная система SB100X состоит из двух компонентов: транспозона, который содержит интересующий ген, окруженный терминальными инвертированными повторами (TR), и транспозазы, которая мобилизует транспозон. После доставки плазмидной ДНК в клетки транспозаза связывает TIF и катализирует иссечение и интеграцию транспозона в геном клетки.

Мы разработали невирусную клеточную аддитивную терапию для лечения неоваскулярной ВМД. Подход включает в себя электропорационную вставку гена PEDF в первичные пигментные эпителиальные (PE) клетки с помощью транспозонной системы SB100X 36,37,38. Генетическая информация транспозазы и PEDF предоставляется на отдельных плазмидах, что позволяет регулировать идеальное соотношение транспозонов SB100X к PEDF. Электропорация выполняется с использованием капиллярной трансфекционной системы на основе пипетки, которая характеризуется максимальным размером зазора между электродами при минимизации площади их поверхности. Было показано, что устройство достигает превосходных скоростей трансфекции в широком диапазоне клеток млекопитающих 39,40,41. Малая площадь поверхности электрода обеспечивает равномерное электрическое поле и уменьшает различные побочные эффекты электролиза⁴².

Антиангиогенная функциональность PEDF, секретируемая трансфектированными пигментными эпителиальными клетками, была показана в различных экспериментах in vitro, анализирующих прорастание, миграцию и апоптоз эндотелиальных клеток пуповинной вены человека⁴³. Кроме того, трансплантация PEDF-трансфектированных клеток в кроличью модель неоваскуляризации роговицы⁴⁴, а также крысиная модель CNV 43,45,46 показали снижение неоваскуляризации.

Здесь мы описываем подробный протокол для стабильной вставки гена PEDF в первичные клетки RPE человека через систему транспозонов SB100X с использованием системы капиллярной трансфекции. Трансфектированные клетки держали в культуре в течение 21 дня и впоследствии анализировали с точки зрения экспрессии гена PEDF с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и с точки зрения секреции белка PEDF путем иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА, рисунок 1).

Protocol

Человеческие донорские глаза были получены из банка ахенской роговицы отделения офтальмологии (Университетская клиника RWTH Aachen) после получения информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией протоколов. Процедуры сбора и использования образцов человека были од?…

Representative Results

Культивирование и электропорация первичных клеток RPE человекаПоказано, что посев достаточного количества первичных РПЭ клеток животного происхождения позволяет культивировать и выращивать до интегрированного монослоя пигментированных, шестиугольных к…

Discussion

В нашем проекте мы стремимся к невирусному производству генетически модифицированных первичных клеток RPE человека, которые постоянно сверхэкспрессируют и секретируют эффективный фактор, чтобы использовать трансфектированные клетки в качестве долгосрочного терапевтического средст…

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054