Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l’istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l’aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un’opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all’età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l’espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 104 cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l’aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un’integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l’analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.
L’età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all’età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista1 e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 20402. Le disfunzioni dell’epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell’AMD. L’RPE svolge molteplici compiti essenziali per una normale funzione retinica3 e secerne una varietà di fattori di crescita e fattori essenziali per mantenere l’integrità strutturale della retina e del coriocapillare, supportando così la sopravvivenza dei fotorecettori e fornendo una base per la circolazione e l’apporto di nutrienti.
Negli occhi sani, il fattore derivato dall’epitelio pigmentato (PEDF) è responsabile del bilanciamento degli effetti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e protegge i neuroni dall’apoptosi, previene la proliferazione delle cellule endoteliali e stabilizza l’endotelio capillare. Uno spostamento del rapporto VEGF-PEDF è correlato alla neovascolarizzazione oculare, che è stata osservata nei modelli animali4,5 e in campioni di pazienti con neovascolarizzazione coroideale (CNV) dovuta a AMD e retinopatia diabetica proliferativa 6,7,8,9,10 . L’aumento della concentrazione di VEGF è l’obiettivo per l’attuale trattamento standard. I farmaci anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, più recentemente, brolucizumab migliorano l’acuità visiva in circa un terzo dei pazienti con CNV o meglio stabilizzano la vista nel 90% dei casi11,12,13. Tuttavia, le frequenti iniezioni intravitreali, spesso mensili, comportano il rischio di eventi avversi14, compromettono la compliance del paziente e rappresentano un onere economico significativo per i sistemi sanitari15. Inoltre, una certa percentuale di pazienti (2%-20%) non risponde o reagisce solo male alla terapia anti-VEGF16,17,18,19. Questi concomitanti negativi richiedono lo sviluppo di trattamenti alternativi, ad esempio impianti intraoculari, approcci terapeutici cellulari e/o genici.
La terapia genica si è evoluta come trattamento promettente per le malattie ereditarie e non ereditarie e intende ripristinare sequenze geniche non funzionali o sopprimere quelle malfunzionanti. Per le malattie poligeniche, dove l’identificazione e la sostituzione dei fattori causali è difficilmente possibile, le strategie mirano alla fornitura continua di un fattore protettivo. Nel caso dell’AMD, sono state sviluppate varie terapie additive, come l’espressione stabile di endostatina e angiostatina20, l’antagonista VEGF tirosin-simile alla tirosin-chinasi-1 (sFLT-1)21,22, il cluster proteico regolatore del complemento della differenziazione 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . L’occhio, e in particolare la retina, è un bersaglio eccellente per un farmaco basato su geni a causa della struttura chiusa, della buona accessibilità, delle piccole dimensioni e del privilegio immunitario, consentendo così una consegna localizzata di basse dosi terapeutiche e rendendo i trapianti meno suscettibili al rigetto. Inoltre, l’occhio consente un monitoraggio non invasivo e la retina può essere esaminata con diverse tecniche di imaging.
I vettori virali sono, a causa della loro elevata efficienza di trasduzione, il veicolo principale per fornire geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, a seconda del vettore virale utilizzato, sono state descritte diverse reazioni avverse, come risposte immunitarie e infiammatorie26, effetti mutageni e oncogeni 27,28 o disseminazione in altri tessuti29. Le limitazioni pratiche includono una dimensione di imballaggio limitata30, nonché difficoltà e costi associati alla produzione di lotti di grado clinico31,32. Questi inconvenienti hanno promosso l’ulteriore sviluppo di vettori non virali basati su plasmidi che vengono trasferiti tramite lipo / poliplex, ultrasuoni o elettroporazione. Tuttavia, l’integrazione genomica del transgene nel genoma dell’ospite di solito non è promossa con vettori plasmidici, risultando così in un’espressione transitoria.
I trasposoni sono frammenti di DNA presenti in natura che cambiano la loro posizione all’interno del genoma, una caratteristica che è stata adottata per la terapia genica. Grazie ad un meccanismo di integrazione attivo, i sistemi vettoriali basati su trasposoni consentono un’espressione continua e costante del transgene inserito. Il trasposone della Bella Addormentata (SB), ricostituito da un antico trasposone di tipo Tc1/marinaio trovato nel pesce33 e ulteriormente migliorato dall’evoluzione molecolare risultante nella variante iperattiva SB100X34, ha permesso una trasposizione efficiente in varie cellule primarie ed è stato utilizzato per la correzione fenotipica in diversi modelli di malattia35. Attualmente, 13 studi clinici sono stati avviati utilizzando il sistema di trasposone SB. Il sistema di trasposone SB100X è costituito da due componenti: il trasposone, che comprende il gene di interesse affiancato da ripetizioni invertite terminali (TIR), e la trasposasi, che mobilizza il trasposone. Dopo la consegna del DNA plasmidico alle cellule, la trasposasi lega i TIR e catalizza l’escissione e l’integrazione del trasposone nel genoma della cellula.
Abbiamo sviluppato una terapia additiva non virale basata su cellule per il trattamento dell’AMD neovascolare. L’approccio comprende l’inserimento basato sull’elettroporazione del gene PEDF in cellule epiteliali pigmentate primarie (PE) mediante il sistema di trasposone SB100X 36,37,38. Le informazioni genetiche della trasposasi e del PEDF sono fornite su plasmidi separati, consentendo così la regolazione del rapporto ideale tra trasposone SB100X e PEDF. L’elettroporazione viene eseguita utilizzando un sistema di trasfezione capillare basato su pipette caratterizzato da una dimensione massima dello spazio tra gli elettrodi, riducendo al minimo la loro superficie. Il dispositivo ha dimostrato di raggiungere eccellenti tassi di trasfezione in una vasta gamma di cellule di mammifero 39,40,41. La piccola superficie dell’elettrodo fornisce un campo elettrico uniforme e riduce i vari effetti collaterali dell’elettrolisi42.
La funzionalità anti-angiogenica del PEDF secreta dalle cellule epiteliali pigmentate trasfettate è stata dimostrata in vari esperimenti in vitro analizzando la germinazione, la migrazione e l’apoptosi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana43. Inoltre, il trapianto di cellule trasfettate con PEDF in un modello di coniglio di neovascolarizzazione corneale44 e in un modello di ratto di CNV43,45,46 ha mostrato un declino della neovascolarizzazione.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’inserimento stabile del gene PEDF in cellule RPE umane primarie tramite il sistema di trasposone SB100X utilizzando un sistema di trasfezione capillare. Le cellule trasfettate sono state tenute in coltura per 21 giorni e successivamente analizzate in termini di espressione genica PEDF mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e in termini di secrezione proteica PEDF mediante immunoblotting e saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA, Figura 1).
Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l’introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere u…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Settimo programma quadro dell’Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione, convenzione di sovvenzione n. 305134. Zsuzsanna Izsvák è stata finanziata dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Gli autori desiderano ringraziare Anna Dobias e Antje Schiefer (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per l’eccellente supporto tecnico e la Banca della cornea di Aquisgrana (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per aver fornito gli occhi del donatore umano.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |